FGD5-AS1和miR-223在川崎病患儿血浆中的水平及意义*

何坤, 王芳洁, 郑瑞利

郑州大学附属儿童医院心血管内科(河南郑州 450000)

川崎病(Kawasaki disease，KD)即小儿皮肤黏膜淋巴结综合征，是一种急性自限性血管炎，好发于婴幼儿，其最主要的临床症状为持续高热，且抗生素治疗无效。近年来，KD发病的婴幼儿越来越多，其发病可能与免疫、感染等多种因素相互作用有关。尽管经静脉注射免疫球蛋白后多数预后良好，但仍有部分患儿存在冠状动脉病变等后遗症，不利于心脏发育，并且可能会增加成年后心血管疾病的发生风险[1]。因此，寻找与KD发病及冠状动脉损伤发生相关的指标，对个体化治疗KD及避免或降低冠状动脉损伤具有重要的临床意义。相关研究显示[2-3]，微小核糖核酸(microRNAs，miRNAs)及长链非编码核糖核酸(long noncoding RNAs，LncRNA)在心血管系统中具有强大的生物学功能，在多种心血管疾病的诊疗中发挥重要作用。微小核糖核酸-223(microRNA-223，miR-223)是作用较广泛的一种miRNAs，参与血管生成、动脉粥样硬化形成等多个过程[4]。已有研究证实[5]，微小核糖核酸-223-3p是KD血管内皮损伤的重要调控因子。而FGD5-AS1作为一种LncRNA，被证实在血管内皮损伤、缺血再灌注损伤等心血管损伤中发挥保护作用[6]。但miR-223及FGD5-AS1在KD发病及患儿冠状动脉损伤发生中的作用尚不十分明确。因此，本研究连续选取75例KD患儿作为研究对象，着重探讨血浆miR-223、FGD5-AS1的表达水平及与冠状动脉损伤发生的关系，旨在为KD的防治提供新思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料 连续选取2019年4月至2021年4月本院收治的KD患儿75例作为KD组，其中男46例，女29例；年龄1～4岁，平均(2.83±0.90)岁。纳入标准：(1)均符合KD诊断标准[7]；(2)均为急性期入组；(3)临床及实验室检查资料齐全。排除标准：(1)入院前接受治疗者；(2)KD复发者；(3)合并其他感染者；(4)存在自身免疫性疾病；(5)存在先天性畸形；(6)伴随其他心血管疾病。另选取同期在本院体检的健康儿童60例作为健康对照组，及本院收治的感染发热患儿60例作为发热对照组。健康对照组男34例，女26例；年龄1～4岁，平均(3.03±0.91)岁。发热对照组男31例，女29例；年龄1～4岁，平均(2.97±0.95)岁。发热对照组患儿纳入标准：(1)肺炎或上呼吸道感染者；(2)临床及实验室检查资料齐全。排除标准：(1)合并其他感染者；(2)存在自身免疫性疾病；(3)存在先天性畸形；(4)存在心脏功能障碍；(5)入组前接受过治疗。3组间性别、年龄具有可比性。本研究经本院医学伦理委员会批准(2019000-12)，且取得所有研究对象家长的知情同意。

1.2 冠状动脉损伤诊断标准[7]KD患儿均接受静脉注射免疫球蛋白和口服阿司匹林治疗，于病程的第14天行心脏超声心动图检查，并根据冠状动脉Z值将75例KD患儿分为无冠状动脉损伤组(Z值<2，n=59)和冠状动脉损伤组(Z值≥2，n=16)。

1.3 方法

1.3.1 标本收集 采集健康对照组儿童体检时，及发热对照组和KD组患儿入院当天外周静脉血，另收集治疗第14天时KD组患儿外周静脉血，每例3 mL并置于肝素抗凝管中，30 min内离心，3 000 r/min离心10 min，提取血浆并分为2份，保存于-80℃低温环境中。1份用于检测血小板计数(blood platelet，PLT)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、血沉(erythrocyte sedimentation rate，ESR)、氨基末端脑钠肽前体(N-terminal pro-brain natriuretic peptide，NT-proBNP)等实验室指标，另1份用于检测血浆miR-223、FGD5-AS1表达水平。

1.3.2 血浆miR-223、FGD5-AS1表达水平检测 采用实时荧光定量PCR检测研究对象血浆miR-223、FGD5-AS1表达水平。以Trizol法(试剂盒购自上海联迈生物工程有限公司)提取细胞总RNA，并按照反转录试剂盒(购自北京索莱宝科技有限公司)说明书将其反转录为cDNA，然后进行PCR反应。FGD5-AS1上游引物：5′-AACAGTGCCTATGTGGACGG-3′，下游引物：5′-CCCATCACAGAGGTCCACAC-3′；FGD5-AS1内参GAPDH上游引物：5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游引物：5′-GAAGATGGTGATGGATTTC-3′。miR-223上游引物：5′-CGGACGTGTATTTGACAAGC-3′，下游引物5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGTA-3′；miR-223内参U6上游引物：5′-TTTATGCTTGAGCCTTGA-3′，下游引物5′-CTTGCCTGAAATACTTGC-3′。反应条件为：95℃、5 min，95℃、10 s，60℃、45 s，运行40个循环。利用公式2-ΔΔCt计算研究对象血浆miR-223、FGD5-AS1的相对表达量。

1.3.3 相关指标水平检测 采用血细胞分析仪(型号：迈瑞BC-5000，武汉科尔达医疗科技有限公司)检测PLT水平。采用全自动化学发光免疫分析仪(型号：罗氏Cobas-E411，上海罗氏制药有限公司)及酶联免疫吸附法试剂盒(货号：IB-E2006，江西艾博因生物科技有限公司；货号：KIT10395A，北京义翘神州科技股份有限公司)检测血浆NT-proBNP、IL-6水平。采用全自动血沉分析仪(型号：Vision-C，上海涵飞医疗器械有限公司)检测ESR水平。

2 结果

2.1 3组研究对象血浆miR-223、FGD5-AS1表达及相关指标水平的比较 3组研究对象血浆miR-223、FGD5-AS1表达及相关指标水平相比，差异均有统计学意义(P<0.05)。KD组、发热对照组患儿PLT、ESR及血浆miR-223、IL-6、NT-proBNP表达水平均明显高于健康对照组儿童(P<0.05)，FGD5-AS1表达水平明显低于健康对照组儿童(P<0.05)。KD组患儿PLT、ESR及血浆miR-223、IL-6、NT-proBNP表达水平均明显高于发热对照组患儿(P<0.05)，FGD5-AS1表达水平明显低于发热对照组患儿(P<0.05)。见表1。

表1 3组研究对象血浆miR-223、FGD5-AS1表达及相关指标水平的比较

2.2 KD患儿治疗前后血浆miR-223、FGD5-AS1表达水平比较 治疗后KD患儿血浆miR-223表达水平明显降低，FGD5-AS1表达水平明显升高(P<0.05)。见表2。

表2 KD患儿治疗前后血浆miR-223、FGD5-AS1表达水平比较

2.3 KD患儿血浆miR-223、FGD5-AS1表达与相关指标水平的相关性 KD患儿血浆miR-223

与FGD5-AS1表达水平呈负相关(r=-0.407，P=0.000)，见图1。经ENCORI数据库预测，miR-223与FGD5-AS1的3′UTR存在相应的结合位点，见图2。KD患儿血浆miR-223表达水平与血浆IL-6、NT-proBNP表达水平呈正相关(r=0.565、0.622，P<0.05)，与PLT、ESR无明显相关性(r=0.205、0.198，P>0.05)；KD患儿血浆FGD5-AS1表达水平与血浆IL-6、NT-proBNP表达水平呈负相关(r=-0.510、-0.487，P<0.05)，与PLT、ESR无明显相关性(r=-0.201、-0.175，P>0.05)。见表3。

图1 KD患儿血浆miR-223表达与FGD5-AS1表达水平相关性

图2 miR-223与FGD5-AS1靶向关系预测

表3 KD患儿血浆miR-223、FGD5-AS1表达与相关指标水平的相关性

2.4 KD患儿有无冠状动脉损伤血浆miR-223、FGD5-AS1及相关指标水平的比较 冠状动脉损伤组患儿PLT、ESR及血浆miR-223、IL-6、NT-proBNP表达水平均明显高于无冠状动脉损伤组患儿(P<0.05)，FGD5-AS1表达水平明显低于无冠状动脉损伤组患儿(P<0.05)。见表4。

表4 KD患儿有无冠状动脉损伤血浆miR-223、FGD5-AS1及相关指标水平的比较

2.5 血浆FGD5-AS1、miR-223表达水平对KD患儿冠状动脉损伤诊断价值分析 血浆FGD5-AS1、miR-223水平联合检测(并联)诊断KD患儿冠状动脉损伤的ROC曲线下面积(AUC)为0.907(95%CI：0.845～0.969)，明显高于血浆FGD5-AS1、miR-223水平单独检测曲线下面积0.819(95%CI：0.742～0.895)、0.824(95%CI：0.751～0.898)(Z/P=1.973/0.024、1.872/0.031)。见表5、图3。

表5 血浆FGD5-AS1、miR-223表达水平对KD患儿冠状动脉损伤的诊断价值

图3 血浆FGD5-AS1、miR-223对KD患儿冠状动脉损伤诊断价值的ROC曲线

3 讨论

KD的主要病理改变为全身性发生血管炎症，易累及冠状动脉，其治疗的主要原则为控制全身血管炎症及减少冠状动脉病变。研究发现免疫球蛋白的早期使用可明显降低KD患儿冠状动脉损伤的发生风险，但由于许多家长担心其安全性而未能及时输注，致使目前冠状动脉损伤的发生概率仍居高不下，严重危害患儿的远期心脏健康[8]。因此，探讨能早期评估KD患儿冠状动脉损伤发生情况的有效指标，对降低冠状动脉损伤发生率、治疗方案的制定及改善患儿远期心脏功能是非常重要的。

miRNAs是一类参与多种基因表达的单链非编码RNA，在心力衰竭、冠心病等生理和病理过程中起重要作用。miR-223属于miRNAs，定位于X染色体q12，在骨髓造血细胞、粒细胞等血液系统中广泛表达[9]。有研究报道，急性心肌梗死和慢性心力衰竭患者血清中miR-223高表达，与心肌细胞凋亡、冠状动脉病变及心脏损伤存在关联[10-11]。Wang等[5]研究中，发现KD急性期患儿血清微小核糖核酸-223-3p表达水平明显高于正常对照者。本研究通过实时荧光定量PCR检测血浆miR-223表达水平，结果发现KD患儿血浆miR-223表达水平最高，其次为发热对照组患儿，健康对照组儿童血浆miR-223表达水平最低，且治疗后KD患儿血浆miR-223表达水平明显降低，与Wang等[5]研究类似，提示血浆miR-223表达水平升高可能参与KD发病。

LncRNA是一类长链非编码RNA，在机体免疫应答、细胞生长分化等生物进程中存在调控作用参与心脑血管、肿瘤等多种疾病的发生发展。有研究报道，急性心肌梗死患者心肌细胞中LncRNA FGD5-AS1低表达，上调FGD5-AS1表达可通过调节miRNA水平提高心肌细胞活力，减少凋亡，改善心肌缺血和缺血再灌注损伤[12]。本研究结果中，KD组、发热对照组、健康对照组血浆FGD5-AS1表达水平依次显著降低(P<0.05)，且治疗后KD患儿血浆FGD5-AS1表达水平明显升高，与既往研究[6,13]在心肌损伤、脓毒症发生中研究结果相似，提示血浆FGD5-AS1低表达可能与KD的发生有关。FGD5-AS1低表达可能促进炎症反应增加、血管内皮细胞异常改变等促使心肌细胞损伤，进而诱导KD的发生[14]。有研究发现，FGD5-AS1与miR-233间存在靶向调控作用，与神经细胞增殖和神经元损伤有关[15]。而本研究结果显示，KD患儿血浆miR-223与FGD5-AS1表达水平呈负相关，且经ENCORI数据库预测，miR-223与FGD5-AS1的3′UTR存在相应的结合位点，表明KD发生发展中FGD5-AS1与miR-233间也存在相互调控作用。陈翠翠等[16]发现通过外源miR-223抑制物干预，有利于减轻KD冠状动脉内皮细胞损伤。本研究中，冠状动脉损伤组患儿血浆miR-223表达水平较无冠状动脉损伤组患儿高，FGD5-AS1表达水平明显低于无冠状动脉损伤组患儿，提示FGD5-AS1、miR-223可能参与冠状动脉损伤发生，临床通过检测血浆FGD5-AS1、miR-223表达水平对评估KD患儿冠状动脉损伤情况有所帮助。

IL-6是由成纤维细胞、单核巨噬细胞等合成并分泌的多功能细胞因子，可通过识别靶细胞表面的人IL-6受体参与多种疾病进展[17]。研究发现KD发病后机体可产生大量的IL-6，引起炎症反应，从而导致冠状动脉损伤[18]。NT-proBNP是一种由心肌细胞合成并分泌的多肽，其水平异常升高可作为判断心肌损伤的依据[19]。江雅静等[20]研究报道，血清NT-proBNP水平升高与KD患儿冠状动脉损伤有关。本研究也得出相似的结果，血浆IL-6、NT-proBNP表达水平及从高至低依次为KD组患儿、发热对照组患儿、健康对照组儿童，冠状动脉损伤组患儿血浆IL-6、NT-proBNP表达水平均较无冠状动脉损伤组高，提示血浆IL-6、NT-proBNP表达水平参与KD发生、发展。此外，Pearson检验分析发现，KD患儿血浆miR-223表达水平与血浆IL-6、NT-proBNP表达水平均呈正相关，FGD5-AS1表达水平与血浆IL-6、NT-proBNP表达水平均呈负相关，进一步提示FGD5-AS1、miR-223与IL-6、NT-proBNP一样，可能作为评估KD患儿冠状动脉损伤发生的有效指标。而PLT、NT-proBNP在发热组患儿血浆中升高，可能原因为发热不仅引发肺炎、上呼吸道感染，还会导致其他脏器受累，影响心脏功能以及炎症反应增加。本研究还通过ROC曲线分析发现，血浆FGD5-AS1、miR-223水平联合检测诊断KD患儿冠状动脉损伤的曲线下面积为0.907，明显高于血浆FGD5-AS1、miR-223水平单独检测曲线下面积，且敏感度较高，提示二者联合检测对KD患儿冠状动脉损伤的诊断价值较高。

综上所述，miR-223在KD患儿血浆中明显升高，参与冠状动脉损伤发生，且与IL-6、NT-proBNP呈正相关，可能为KD的防治及减少冠状动脉损伤提供帮助。但本研究有一定局限性，样本量少且未进行远期随访，miR-223在KD发病机制中的具体作用，需增加样本并延长随访进一步探讨。

利益相关声明：所有作者均声明不存在任何利益冲突。

作者贡献说明：何坤提出研究思路、设计研究方案、实施研究过程、论文撰写；郑瑞利资料收集整理，进行统计学分析，王芳洁指导论文修改。