富含苹果皮根皮素壳聚糖-聚乙烯醇抗氧化保鲜膜的研制

陶海燕， 赵丽凤， 陈 刚， 夏 娜， 贾淑平， 李盛彪

(1.喀什大学化学与环境科学学院, 新疆 喀什 844000;2.喀什大学新疆特色药食用植物资源化学实验室， 新疆 喀什 844000; 3.华中师范大学化学学院， 武汉 430079；4.喀什地区纤维检验所， 新疆 喀什 844099; 5.喀什大学生命与地理科学学院， 新疆 喀什 844000)

人口增长导致塑料包装的消费增加，不可降解材料的处理引起了一系列的环境问题.目前，人类已开始选择使用环保的可再生包装材料[1].生物基活性包装材料由于安全可降解日益受到人们的青睐，这些材料通常由生物高聚物组成，包括蛋白质、多糖、脂类或它们的混合物，它们可以替代塑料等合成聚合物[2].壳聚糖(CS)是由β-(1,4)-糖苷键连接的N-乙酰氨基葡萄糖和N-氨基葡萄糖的共聚物，具有良好的生物相容性、生物降解性、黏附性和低毒性，其LD50剂量与糖或食盐相同[3-4].聚乙稀醇(PVA)是一种无色无毒、可生物降解、无刺激性的多羟基高分子化合物，常温下，其性质稳定，具有良好的力学性能.将CS与PVA混合制膜用于食品包装领域具有较大的潜力.

近年来，研究人员关注于将a-生育酚、酚类化合物和精油等天然生物活性化合物掺入包装材料中，以生产活性保鲜薄膜，在不使用合成防腐剂的情况下提高食品的保质期同时保持食品的安全性和质量[5].果皮是生物活性化合物和天然抗氧化剂的丰富来源，被广泛应用于基于生物聚合物的薄膜的制备，以提高其生物功能.苹果[6]、香蕉[7]、柚子[8]、石榴[9]、木瓜和菠萝蜜[10]、血橙[11]、土豆[12]果皮被用于提高生物聚合物薄膜的抗氧化和抗菌活性.根皮素(phloretin)作为6 000种黄酮类化合物中的一种，具有抗癌、抗破骨细胞生成、抗真菌、抗病毒、抗炎和抗菌特性而受到广泛的关注[13-14].苹果皮是根皮素的主要来源，由于其常被当废物丢弃而忽视其利用价值，因此，根皮素作为极具价值的副产物可以作为酚类化合物的重要来源，用于丰富壳聚糖复合保鲜膜，并提高其抗氧化性能.目前尚无将根皮素加入壳聚糖复合物制备活性和抗氧化膜的研究.本实验使用CS、PVA和不同浓度的根皮素作为原料生产生物可降解和生物活性的包装膜，进一步研究其作为一种新型活性包装体系的物理、机械、结构、抗氧化和抗菌特性.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苹果皮(红富士品种，购自超市)，晒干粉碎；聚乙稀醇(PVA)食品级，购自上海麦克林生化科技有限公司；壳聚糖(CS，脱乙酰度98%)，食品级，购自上海麦克林生化科技有限公司；1，1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)，分析纯；购自国药集团有限公司； 甘油，分析纯级，天津市河东区红岩试剂厂.

1.2 仪器与设备

D/Max-2500型全自动X射线衍射仪(日本理学)；Hitachi SU3500型扫描电子显微镜(SEM日本日立公司)；Nicoletis50傅立叶红外光谱仪(美国赛默飞世尔科技公司)；Mitutoyo7327型厚度仪(日本三丰)；CMT-6104万能拉力机(深圳新三思测试仪器有限公司)；SDT2960 DTA-TGA热重分析仪(TG，德国耐磁公司)，TU-1900双光束紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)；FLC-3超净工作台(哈尔滨市东联公司).

1.3 试验方法

1.3.1 苹果皮根皮素提取及纯化 提取方法参照文献[15]的方法, 准确称取10.00 g的苹果皮干粉，采用表面活性剂胶束辅助酶法和超声—微波协同提取法提取苹果皮根皮素，将提取液在60 ℃以转速8 000 r·min-1条件下离心10 min、抽滤，滤液脱色处理，大孔树脂纯化后，在40 ℃条件下蒸发去溶剂，得到固体物质，即得纯品，含量大于98%.按照不同质量浓度要求配制苹果皮根皮素提取液.

1.3.2 复合膜的制备 准确称取16.00 g的壳聚糖粉末于体积分数1%的醋酸溶液800 mL中，60 ℃条件下用磁力搅拌器搅拌1 h使其完全溶解制得质量分数2%壳聚糖溶液.同时加入质量分数1%的PVA搅拌均匀形成壳聚糖与PVA共混溶液.随后在壳聚糖与PVA共混溶液加入0%、1%、2%和3%苹果皮根皮素乙醇液(相对于壳聚糖干基质量分数)，再加入2 mL的甘油作为增塑剂，搅拌2 h，待混合液充分混匀，静置24 h脱泡.然后将混合膜液倾倒在聚四氟乙烯皿内，室温下干燥48 h，将干燥的薄膜从培养皿表面剥离，储存于装有饱和硝酸镁的溶液恒温恒湿箱中(相对湿度50%，温度25 ℃).

1.3.3 复合膜的表征

1) 机械性质的测定

选取平整、光滑待测膜，使用测厚仪随机取的4个顶点和一个中心点进行厚度测定，取平均值为厚度，单位为mm.

参照 GB/T 1040.3—2006《塑料拉伸性能的测定第3部分》方法[16]，利用万能拉力机，测定膜样品的抗张强度和断裂伸长率.将膜裁成2 cm×15 cm的长方形样品，初始夹距为10 cm，拉伸速率0.8 mm·s-1，每组膜测定3次取平均值.

式中，σ为拉伸强度(N)；p为最大负荷(N)；b为膜的宽度(mm)；d为膜厚度(mm)；

式中，ε为断裂伸长率(%)；L为膜在断裂时的长度(mm)；L0为膜的初始长度(mm).

2)含水率(MC)和水蒸气透过率(WVP)测定

含水率：在105 ℃的烘箱中将待测膜烘干24 h，以干基含水量表示，每组膜重复测定3次：

式中，MC为含水率(%)；m为待测膜质量(g)；m0为待测膜干质量(g).

根据GB/T 1037—1988《塑料薄膜和片材透水蒸汽性试验方法》测定水蒸汽透过系数的测定[17]，相对湿度60%，温度23 ℃，每个待测膜重复测3次，取平均值，计算水蒸气透过系数(WVP)：

式中，WVP为水蒸气透过系数(g·mm·h-1·m-2·kPa-1)；m为透过膜的水分的质量(g)；L为膜的厚度(mm)；A为膜的有效面积(m2)；t为水分透过时间(h)；ΔP为膜两侧水分蒸汽压差(kPa).

3) 傅里叶变换红外光谱分析(FTIR)

将膜样品充分干燥2周后，剪成 30×30 mm 大小的方形膜片，用傅里叶变换红外光谱仪将分辨率设为2 cm-1，在500～4 000 cm-1波数范围内，进行红外扫描，扫描15次，观察膜样品的化学结构和基团变化，记录各样品的红外光谱图.

4) 复合膜X-射线衍射光谱(XRD)测定

室温条件下，以Cu-Kα射线源(λ=0.154 06 nm)，电功率为2 000 W(40 kV×50 mA)，扫描角度(2θ)是5～40 °，扫描速度为 4°·min-1，步长0.01 °.使用X-射线衍射仪记录各种膜的X-射线衍射图谱.

5) 复合膜热重分析(TG)

称取根皮素、CS、PVA、CS-PVA及CS-PVA-PP复合膜各5 mg，检测温度为0 ℃到800 ℃，升温速率为10 ℃·min-1，及时观察实验现象并处理数据，对各样品的热稳定性进行分析.

6) 复合膜扫描电镜分析(SEM)

将充分干燥并脱水后的膜样品，在液氮中截裂，在真空下，分别对固定在样品台的待测膜的水平面与横断面进行喷金处理，厚度约为 10 μm.在加速电压为10 kV，通过放大不同倍数，观察待测膜的截面和表面的微观结构形貌，拍摄图片记录.

7) 抗氧化特性

准确称取50 mg的薄膜样品浸提在10 mL蒸馏水中,搅拌2 h后以4 000 r·min-1速率离心5 min，上层清液评估其抗氧化性能.

膜提取物的ABTS+自由基清除活性根据于志龙等[18]方法改进，制备ABTS溶液(7.4 mmol·L-1)和过硫酸钾(2.6 mmol·L-1)，并将两者混合后置于黑暗处，室温保存16 h，形成ABTS自由基溶液.用蒸馏水稀释原液，在734 nm处调整吸光度至0.700 ± 0.001.100 μL膜提取液或100 μL蒸馏水与1.0 mL的ABTS溶液混合10 min后保存在一个黑暗的地方.读取样品在734 nm处的吸光度，按式(1)测定其清除活性.

(1)

式中，As为样品吸光值，Ac空白吸光值.

膜提取物清除DPPH自由基的活性根据Parveen等[19]的方法，并进行调整.用乙醇配制DPPH溶液(0.1 mmol·L-1).然后取不同浓度提取液0.5 mL和对照样品(0.5 mL蒸馏水)加入到1.5 mL的DPPH溶液中，避光静置 30 min，读取样品在517 nm处的吸光度，按式(2)测定其清除活性.

(2)

式中,As为样品吸光值，Ac空白吸光值.

膜提取物对铁离子的还原能力的测试.将0.5 mL的膜提取物混合与1.25 mL铁氰化钾质量分数1%和1.25 mL的磷酸盐缓冲剂(0.2 mol·L-1，pH值6.6)后在50 ℃下静置20 min.得到的溶液与1.25 mL的柠檬酸(10%)溶液混合后在4 000 r·min-1下离心10 min.将1.25 mL上清液中加入1.25 mL蒸馏水(含有250 μL的0.1% FeCl3)中，读取样品在517 nm处的吸光度[20].

8) 抗菌特性

根据Zhang等[21]的方法，测定了保鲜薄膜对大肠杆菌O157:H7的抑菌圈直径来定性抑菌活性.将滤纸切成直径为10 mm的圆形完全浸没于复合膜提取液中24 h后取出，用紫外线灯杀菌约20 min，然后置于已接种上述病原体的固体培养基表面.37 ℃培养24 h，培养期结束后，测量滤纸周围透明区域的直径.

2 结果与讨论

2.1 拉伸强度和断裂伸长率

抗拉强度(TS)是膜机械性能参数，代表在外力拉扯下膜断裂的难易程度，高TS膜更有利于保持其在实际应用过程中的完整性[22].利用万能拉力机对富含根皮素CS-PVA复合膜、纯CS膜、CS-PVA复合膜和纯PVA膜进行机械性能测试，结果见表1.

表1 CS、PVA、CS-PVA及CS-PVA-PP复合膜膜厚和机械性能

由表1可看出，纯PVA膜的拉伸强度、断裂伸长率均高于纯CS膜，表明纯PVA膜机械性能优于CS膜.由于根皮素具有疏水性，随着两者复合膜中加入苹果皮根皮素，复合膜的拉伸强度、断裂伸长率逐渐增加，同时又改变了—NH2和—OH基团的分子间作用力，增加了分子之间的交联，使膜结构稳定，复合膜的机械性能提高[22].随着根皮素加入，复合膜机械性能增加，断裂伸长率呈下降的趋势.其拉伸强度和断裂伸长率分别为134.7 MPa和9.5%远高于纯CS膜.

2.2 含水率和水蒸气透过率

含水率大小反映保鲜膜维持水分能力的强弱，含水率较低，保鲜效果较好.水蒸气过率(WVP)是衡量保鲜膜阻水性的一个重要指标.在相同的条件下，其数值越小，说明水蒸气越不易透过，复合膜阻隔水的性能、防潮防腐效果越好，有利于延长食品的货架期[23].

由表2可知，纯CS膜含水率和WVP值最高，分别达到28.25%和54.7 g·cm-2·s-1，说明其含水率较高，对水蒸气的阻隔能力较差.膜中含水率随着根皮素的增加而逐渐下降，主要是根皮素与CS-PVA复合膜之间相互作用，从而限制了复合膜与水分子的相互作用，所以水蒸汽通过率也降低.可能形成静电复合物，使膜分子间紧密排列，网络结构更加致密，改善了薄膜对水蒸气的阻隔性[23]，推测原因可能也是由于根皮素本身含有大量非亲水基团，也改善了薄膜对水蒸气的阻隔性.

表2 CS、PVA、CS-PVA及CS-PVA-PP复合膜膜厚、含水率和水蒸气透过系数值

2.3 TG分析

如图1所示，纯PVA膜和纯CS膜的热分解可分为三个阶段，首先主要是膜水分和乙酸残留蒸发[24]：在0～130 ℃纯PVA膜和纯CS膜质量损失约为2.62%和6.18%；再次主要是聚合物主链的热分解：纯PVA膜聚合物主链的热分解在200～317 ℃，质量损失为50.16%，最大失重速率温度为285 ℃，纯CS膜聚合物主链的热分解在130～520 ℃，质量损失为64.19%，最大失重速率为340 ℃；最后800 ℃时，PVA的总失重率达到96.33%，CS的总失重率为67.92%.根皮素在0～100 ℃之间没有热解反应发生，表明没有自由水的存在.主要在212～460 ℃阶段发生降解，800 ℃时，根皮素最终质量损失为65.97%.从图1热分解曲线可以发现，PVA热稳定性比CS的差，两者复合膜的热稳定性仅有较少的提高.由于根皮素有着较高的稳定性，添加根皮素后的CS-PVA复合膜的稳定性显著高于CS-PVA复合膜.三元复合膜的失重温度和平台，都不同于单纯的CS、PVA及根皮素，CS-PVA-PP三元复合物的第一个失重温度略高于其他单组分，也说明了三者之间通过氢键作用将水锁在复合膜内，从而提高了膜的保水能力和稳定性.

图1 CS、PVA、根皮素、CS-PVA及CS-PVA-PP复合膜的热重分析谱图

2.4 FT-IR

图2为所制备样品的红外光谱图.从图中可知，单纯苹果皮根皮素的吸收峰位于3 204 cm-1、1 654 cm-1和1 501 cm-1处，分别对应根皮素的—OH、C=O和苯环C=C伸缩振动吸收峰.纯CS膜在3 700～3 200 cm-1区域的宽峰由—OH和—NH2的伸缩振动引起，1 532 cm-1处对应乙酰氨基的特征峰，属于C-H弯曲振动和N—N伸缩振动峰[25].1 374 cm-1处较弱的吸收峰为—CH3和乙酰氨基的变形振动，1 053 cm- 1处的峰对应CS的C—O—C伸缩振动峰[26].纯PVA膜的FTIR光谱图中，在2 918 cm-1处的吸收峰对应碳氢键的伸缩振动，3 258 cm- 1和1 422 cm-1对应—OH的伸缩振动及C=C的弯曲振动，在1 095 cm-1处的吸收峰对应由C—O—C伸缩振动特征峰.CS-PVA复合膜与添加根皮素后的CS-PVA-PP膜较PVA膜FTIR光谱处的吸收峰由低波数向高波数方向移动，—OH由3 258 cm-1移动到3 269 cm-1处，C—H伸缩振动吸收峰2 918 cm-1移动至2 920 cm-1处.从FTIR光谱图可以看出：添加根皮素后的CS-PVA复合膜没有发生有化学键断裂和生成的化学反应，所以在图谱上没有观察到新的特征峰出现和消失.

图2 CS、PVA、根皮素、CS-PVA及CS-PVA-PP复合膜的红外谱图

2.5 XRD

图3为所制备样品的XRD图谱.CS膜的两个主要衍射峰为2θ=9.3 °和 20.6 °，PVA膜有 1个主要衍射峰，2θ值在19.7 °，而 20.6 °的衍射峰不太明显；苹果皮根皮素主要有4个衍射峰，2θ值分别在8.08 °、10.74 °、20.04 °、28.26 °处，有较好的晶体形态.PVA膜与CS膜基本上不存在晶型结构.添加根皮素的壳聚糖PVA复合膜较未添加根皮素的CS-PVA复合膜的2θ在19.56 °出现了较宽的衍射峰，保留了根皮素在2θ值为20 °左右的衍射峰，从而说明CS、PVA分子与苹果皮根皮素分子之间发生相互作用，即混合基质膜中CS、PVA与根皮素的复合物堆积的有序性.

图3 CS、PVA、根皮素、CS-PVA及CS-PVA-PP复合膜的XRD谱图

2.6 SEM

复合膜的微观结构，通过SEM分别对其表面和断裂截面进行观测，其结果如图4所示.由复合膜表面SEM观测结果可以看出：纯CS膜表面呈不规则絮状，纯PVA膜、CS-PVA膜、CS-PVA-PP膜表面均无裂纹，细腻光滑，无气孔，无明显的颗粒物存在.对断裂截面分析，发现除纯CS膜断裂截面较为粗糙，其余三种膜断纹较清晰整齐.由此，可以断定壳聚糖、聚乙烯醇、苹果皮根皮素三者间相容性极高，三者通过分子间的氢键，按照一定的规则有序排列，其流平均一，成膜形态较好.

注：复合膜中添加3%根皮素

2.7 抗氧化活性及抗菌性能

通过测定复合膜对DPPH和ABTS自由基的清除能力及还原能力来研究根皮素对壳聚糖复合膜抗氧化性能的影响.由表3可以看出，随根皮素添加量增加壳聚糖复合膜抗自由基活性和还原能力也随之增加，这可能与根皮素原本的抗氧化活性有关.研究结果表明，添加根皮素后制备的壳聚糖复合膜的抗氧化活性大大提高，这可能有利于商业用途，如食品包装的高氧化易感性.Kumar等[27]也研究了类似的结果，壳聚糖-普鲁兰薄膜的抗氧化性可以通过添加生物活性酚类化合物来提高.

表3 不同浓度根皮素(PP)CS-PVA复合膜的清除自由基(ABTS和DPPH)活性、还原能力和抗菌活性

通过测定抑菌圈直径，研究了薄膜对革兰氏阴性(E.coli)菌株的抑菌性能如图5所示.对照壳聚糖复合膜对供试菌株有较弱的抑菌活性，但含有根皮素的薄膜样品对单核细胞大肠杆菌有较好的抑制作用且根皮素浓度越高的膜具有的抗菌活性越高.根皮素含量为3%的壳聚糖复合膜抑制效果最好.此结果与Ali等研究结果一致，他们研究了淀粉基膜对金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的抗菌活性是通过添加酚类活性物质而提高的[28].因此，以CS-PVA复合膜和根皮素为原料制成的薄膜是开发抗菌包装系统的理想材料之一.

图5 不同浓度根皮素(PP)CS-PVA复合膜的抑菌效果

3 结论

本研究以不同浓度的苹果皮提取物根皮素作为活性物质来源，成功的与CS、PVA复合形成薄膜，开发出一种具有抗氧化抗菌包装膜.根皮素的加入增加了CS-PVA复合膜的热稳定性、拉伸强度和水蒸气透过率，降低了其断裂伸长率.从FTIR，XRD、SEM测试结构来看，CS-PVA-PP复合膜通过氢键作用，相容性良好.形成了按照一定规则有序组装的，均一、稳定的复合膜，该复合膜具有更强的保水能力，并且很好的保留了CS、PVA和根皮素的功能性.根皮素的加入显著提高了CS-PVA复合膜还原力、抗自由基活性和抗菌性能.根皮素作为食品工业的一种低成本副产品，在生物聚合物膜中应用以及改善其生物功能特性方面具有很大的潜力.