丹系长白种猪“二胎综合征”全基因组关联分析研究初报

崔茂盛，李千军，张丰霞，江慧青，兰可心，郑璐璐，王 敏，孙红梅，马 墉*

（1.天津市农业科学院畜牧兽医研究所，天津 300381；2.天津农学院动物科学与动物医学学院，天津 300380；3.天津市柯宝畜牧养殖专业合作社，天津 300000）

繁殖成绩是猪场饲养管理的核心，然而受到饲养管理和遗传等因素的影响，初产母猪较易出现难产、产程长、产后易感染、乳房发育不良、二胎窝产仔数少、断奶后反复发情、奶水不足等等现象，俗称为“二胎综合征”。母猪“二胎综合征”发生率在饲养管理水平不同的猪场中差异较大。管理水平较高的规模化猪场发生率较低，约为10% 左右，而饲养管理水平相对较差的小养殖场户，“二胎综合征”发生率可达30%，甚至更高。“二胎综合征”的出现严重影响母猪繁殖成绩，并造成二胎母猪较高的淘汰率，给猪场带来较大的经济损失。影响母猪“二胎综合征”的发生主要有2 个方面的原因：在饲养管理上，主要是配种日龄过早、营养储备不足、缩短哺乳期、断奶与配种时间间隔短等等；在身体发育方面，个别母猪发育缓慢，在配种日龄生殖器官没有充分发育，特别是骨架、骨盆和产道发育状态对“二胎综合征”影响较大。本课题组前期对母猪“二胎综合征”产生的原因、机理及防治方法等做了大量文献调研，并首次提出科学的饲养管理虽然能够降低母猪“二胎综合征”的发生率，但并不能彻底解决母猪“二胎综合征”问题，如果将分子标记，特别是将基因组选育（GS）技术应用于“二胎综合征”母猪的研究，筛选出母猪“二胎综合征”相关的SNP 分子标记，必将大大提高无“二胎综合征”母猪选育的精确性，再辅以科学规范的饲养管理，有望从根本上解决母猪“二胎综合征”问题。

在大量文献调研及对母猪“二胎综合征”充分认识的基础上，本团队于2020 年3—5 月期间对503 头250日龄丹系长白发情待配后备种猪的胸围、尻长和外阴长宽等体尺性状进行了测量，并将全基因组测序信息与体尺性状进行关联分析。本课题组在国内外首次利用全基因组关联分析（Genome-Wide Association Studies，GWAS）技术，研究母猪“二胎综合征”和体尺性状之间的内在联系，该研究结果为进一步探讨母猪“二胎综合征”发生的分子机理提供了新的研究思路和工作基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 来自天津某大型种猪场的丹系长白250日龄左右的后备母猪586 头，体重均在120 kg 以上，母猪体况良好，每头猪都出现过2～3 次发情周期。

1.2 表型测定和方法 在初次配种时测定母猪胸围、尻长和外阴长宽等体尺性状，并采集耳组织样本进行全基因组检测分析。体尺性状测定方法分别为：

胸围：在猪肩胛骨后缘部位使用软皮尺围绕胸部一圈，松紧度以皮尺自然贴紧毛皮为宜，这一圈皮尺的周长即为胸围；

尻长：使用钢质卷尺测量从腰角前缘至臀端后缘的平直距离；

外阴长宽：使用软皮尺测量从外阴的上端至下端距离为长，在外阴长度的中间位置测量外阴左右之间的距离为宽。

1.3 母猪“二胎综合征”发生率统计 本实验中初次配种母猪数为586 头，配种妊娠率为86.5%，即有507 头母猪妊娠，后来有3 头流产、1 头因病淘汰，最终503头母猪顺利产仔。在二胎时，统计该503 头母猪的“二胎综合征”发生率。本实验中，在母猪膘情、环境条件、饲养管理和配种技术水平等等相对一致的条件下，头胎母猪28 d 断奶后出现如下任何一种现象即被判断为“二胎综合征”：①断奶后超过10 d 及以上才发情的母猪；②断奶后母猪发情征兆不明显、静立状态差或屡配不上的母猪；③二胎时奶水情况明显差于第1 胎时的母猪；④头胎产仔数在10 头以上，而二胎产仔数小于5 头的母猪。

1.4 基因组DNA 提取 采用磁珠法提取猪的耳组织基因组DNA，检测所有DNA 样品的浓度和OD 值，保证每份DNA 样品的浓度均大于50 ng/μL，OD260/OD280为1.7～1.9，样品DNA 浓度和纯度均符合要求。对基因组DNA 样品进行琼脂糖凝胶电泳，DNA 条带清晰，无拖尾现象，亮度均一，确保基因组DNA 样品质量较好，无蛋白质污染，也无降解。

1.5 基因组DNA 分型及质控 使用康普森农业科技有限公司“中芯一号”50K SNP 芯片对基因组DNA 进行分型，基因分型实验流程：利用NaOH 溶液对基因组DNA 进行碱变性，恒温过夜后进行基因组全扩增，利用酶切将DNA 片段化，然后进行DNA 沉淀和重悬，随后进行SNP 芯片杂交及清洗，对单碱基延伸及染色后扫描芯片，最后通过iScan 扫描系统读取数据。获得的原始芯片数据首先用Beagle 5.0 软件进行基因型的填充，用Plink 1.9 软件进行基因型的质控，按照以下质量控制标准筛除不合格的样本和DNA 位点：只使用常染色体上的位点，最小等位基因频率大于0.01、哈代-温伯格平衡检验的值大于10，检出率大于90% 的SNP 位点。

1.6 群体结构分析 由于群体分层是造成GWAS 分析假阳性的主要原因，因此采用Plink 1.9 对SNP 分型数据构建亲缘关系矩阵（G 矩阵）及主成分分析（PCA），之后采用R 语言的ggplots 和heatmap 函数绘制热图，采用解释方差最大的前3 个主成分进行散点图的绘制以及分析群体结构。

1.7 GWAS 分析 本研究使用GEMMA 软件构建混合线性模型进行GWAS 分析，模型如下：

其中，为表型向量，X为群体结构效应和场、年、季等固定效应，Zγ为待检验标记效应，～N（0，ϕ）为多基因效应，e～N（0，）为残差效应。多基因效应中的为标记推断的亲缘关系矩阵。

1.8 候选基因筛选和功能富集分析 本研究根据GWAS分析得到的显著的SNP 位点，使用ANNOVAR 软件将显著性SNP 位点上下游基因筛选为潜在候选基因，然后使用clusterProfiler 包将注释到的候选基因根据GO数据库和KEGG 数据进行基因功能富集分析。

2 结果

2.1 母猪“二胎综合征”发生率 依据本实验中母猪“二胎综合征”判断标准，503 头二胎母猪中共有86 头发生“二胎综合征”现象，母猪“二胎综合征”发生率为17.1%（86/503）。

2.2 体尺性状数据正态分布分析结果 对所有503 个样品进行初步统计，胸围、尻长和外阴长宽等体尺性状的标准差和变异系数都为均值分布，其基本遵循正态分布规律。随后，正态性检验结果进一步证明胸围、尻长和外阴尺寸等指标数据符合正态分布，说明样品有较好的代表性。

2.3 基因型数据质控结果 本研究经质控检测后剔除的个体和SNPs 包括：检出率小于90%的个体0 个，位点检出率小于90%的SNPs 有384 个，最小等位基因频率<0.01 的SNPs 有9 831 个，偏离哈代-温伯格（<10）的SNPs 有188 个。最终共有503 个体和44 495 个SNPs 用于随后的关联分析研究。

2.4 群体结构分析 通过PCA 分析，提取解释方差最大的前3 位PCA，绘制对应散点图以反映群体结构，结果见图1。可见，503 个样本绝大多数个体聚集在同一区域，没有个体偏离群体，说明本研究中的混合线性模型GWAS 分析较好适用于本研究猪群体。

图1 群体结构分析

2.5 猪“二胎综合征”性状GWAS 分析 由图2 可知，所有检验显著的3 个SNP 位点信息见表1。GWAS分析结果显示，与胸围显著相关的SNP 位点有1 个（），位于4 号染色体上的84983220 位置，坐落在NPBWR1 和ST18 基因之间；与尻长显著相关的SNP 位点有2 个（），其中SNP 位点在10 号染色体上的6441750 位置，坐落在和基因之间、SNP 位点在12 号染色体上的43594186 位置，坐落在和基因之间。本实验中，没有关联到与外阴尺寸显著相关的SNP。

表1 GWAS 分析显著SNP 位点

图2 胸围、尻长和外阴尺寸等3 个体尺性状的GWAS 结果曼哈顿图

与胸围性状显著相关SNP（CNC10041611）相邻的基因和与尻长性状显著相关SNP（）相邻的、显著相关SNP（）相邻的等3个基因虽有注释，但在基因功能富集（GOenrich）中，这3 个基因功能都没有被收录，说明这3 个基因的功能可能没有被研究过。

3 讨 论

有关猪“二胎综合征”产生的原因，国内外研究者已做了大量探讨，普遍认为“二胎综合征”的发生率与饲养管理如配种日龄、营养水平和哺乳时间等因素有关。但有调研报道指出，即使在管理水平较高的大型规模养殖场，仍有10%左右的母猪会发生“二胎综合征”。但该报道同时也指出，一些母猪生长发育缓慢，特别是骨架、骨盆和产道发育状态对“二胎综合征”影响较大。因此本研究团队推测，尽管母猪“二胎综合征”的发生率与上述饲养管理水平的高低有关，但“二胎综合征”也可能与某些基因的表达有关。基于此，本研究团队在2020 年3—5 月期间对586 头250 日龄丹系长白后备种猪开展了全基因组检测，并测量了与生长发育和生殖道相关的体尺性状如尻长、胸围和外阴的长和宽等，利用GWAS 技术，探讨与猪“二胎综合征”紧密相关的分子标记，为无“二胎综合征”母猪品种选育提供技术支撑。

目前GWAS 已广泛应用于候选基因筛选相关研究，如杜洛克母猪初情期日龄的相关研究、猪腹股沟/阴囊疝易感基因的筛选、杜洛克猪生长性状研究以及不同种猪瘦肉量全基因组关联分析等等。但到目前为止，还未见利用GWAS 技术探讨猪“二胎综合征”相关分子标记的研究报道。本研究利用全基因组检测技术对503 头250 日龄丹系长白母猪的胸围、尻长和外阴长宽等体尺性状开展了GWAS 分析。关联分析结果显示，与胸围体尺性状显著相关的SNP 分子标记有1 个，其相邻2 个候选基因分别为和基因。经基因功能分析，基因主要与神经多肽和G 蛋白偶联的多肽等肽类蛋白受体活性显著相关；而基因的功能暂未有研究报道。与尻长体尺性状显著相关的SNP 分子标记有2 个，其中SNP（）相邻2 个候选基因分别为和。基因功能分析结果显示：基因主要参与神经发育、细胞分裂、细胞周期与细胞分化等过程；而基因的功能暂未有研究报道；SNP（）相邻2 个候选基因分别为和。经功能分析，基因的分子功能主要为糖基化合物或具有糖基键化合物的水解酶活性，在细胞功能活动中主要与有性繁殖，如精卵结合、胚胎和器官组织发育等显著相关。没有关联到与外阴尺寸显著相关的SNP分子标记，这可能与样本量不够大有关，如果进一步扩大样本量，是否能够检测到与外阴尺寸显著相关的SNP分子标记，还有待进一步验证。但是，从目前课题组得到的猪“二胎综合征”GWAS 分析结果来看，和胸围显著相关SNP 相邻的基因与蛋白代谢紧密相关、和尻长显著相关SNP 相邻的基因与神经发育、细胞分化、细胞周期等紧密相关；特别是和尻长显著相关SNP 相邻的基因与繁殖过程如受精和胎儿组织器官生长发育等紧密相关。目前，本课题组正在开展上述3 个SNP 分子标记的功能验证工作，期望得到与猪“二胎综合征”紧密相关的SNP 分子标记，为开展无“二胎综合征”种猪选育提供理论依据和科学支撑。

4 结 论

本团队将503 头丹系长白后备母猪全基因组测序结果与胸围、尻长和外阴长宽等体尺性状进行了关联分析，筛选到1 个SNP 与胸围性状显著相关、2 个SNP与尻长性状显著相关；与该3 个SNP 相邻的6 个基因中，具有功能注释的基因3 个，分别和蛋白代谢、神经发育、细胞分化、细胞周期以及胎儿组织器官生长发育等紧密相关，研究结果为后续开展无“二胎综合征”种猪分子选育奠定了基础。