外源褪黑素对镉胁迫下小麦幼苗生长生理特征及镉含量的影响

张珂，李依，厉萌萌，刘德权，刘可欣，张凌基，马闯,

1.郑州轻工业大学 材料与化学工程学院，河南 郑州 450001；2.环境污染治理与生态修复河南省协同创新中心，河南 郑州 450001；3.森特士兴集团股份有限公司，北京 100176

0 引言

在经济全球化进程中，工业生产过程中所产生的废气、废水和废渣的大量排放及农业生产过程中化肥、农药的不合理施用，造成含有重金属的污染物以各种途径进入到土壤中，对土壤环境和土壤质量构成严重危害[1-2]。目前，我国耕地总面积中，受重金属污染的耕地面积高达10%以上，其中，受重金属镉(Cd)污染的耕地面积占重金属污染耕地面积的25.2%，且每年所产出的Cd超标农产品高达1.46×109kg[3]。土壤中的Cd并不参与生物的代谢活动，但当植物过量吸收Cd时，植物的生长、发育、生理生化等会受到不同程度的抑制，使植物生长发育迟缓、代谢紊乱、果实或作物产量和质量下降，甚至导致植物死亡[4-6]。近年来，为减轻Cd对农作物的毒性并阻隔其在作物器官中的积累，外源添加生长调节剂是一种缓解农作物受Cd影响的有效方法[7-9]。

褪黑素(松果体素)是一种吲哚类激素，具有抗氧化功效，在动、植物的生理活动和代谢活动中发挥着重要作用[10]。褪黑素在生物体内含量微少，研究发现[11-12]，外源褪黑素的添加能通过清除自由基、提高抗氧化酶活性等方式提高植物对逆境(紫外线辐射、高温、低温、干旱、重金属胁迫等)的耐受性及对病虫害的抵抗能力。J.Ni等[13]的研究结果显示，外源褪黑素的添加大大减轻了Cd对小麦幼苗的毒性，促进了根系的生长，增加了小麦幼苗的高度和生物量的积累，小麦幼苗中抗坏血酸过氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性均有显著的提高；此外，该研究还发现，褪黑素能够通过平衡Cd胁迫诱导的内源性过氧化氢水平来防止外源过氧化氢对根的毒害。由此可见，外源褪黑素可通过对作物抗氧化系统的调节有效减缓Cd对作物生长发育的影响。

小麦是我国仅次于水稻和玉米的第三大粮食作物。农田土壤中的Cd易被小麦根系吸收、转运到地上部分，并在籽粒中积累[14]。作物幼苗的生长情况是作物生物量和产量的重要基础。因此，研究外源褪黑素对缓解重金属胁迫下作物幼苗生长的影响具有重要的现实意义。然而，关于外源褪黑素添加对植物生长的影响研究主要集中在干旱、盐等[15-16]自然因素的胁迫，而对重金属胁迫下褪黑素对植物的影响研究较少。鉴于此，本研究拟通过室内培养实验，探讨外源褪黑素的添加对Cd胁迫下小麦幼苗生长、生理特征及小麦对Cd吸收的影响，以期为农田土壤的Cd污染防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

主要材料：小麦种子矮抗58，购自河南省农业科学院；Cd胁迫试剂氯化镉(CdCl2·2.5H2O)和外源褪黑素，均购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

主要仪器：JOANLAB型万分之一电子分析天平(感量0.000 1 g)，宁波市鄞州群安实验仪器有限公司产；QHX-400BS-Ⅲ型人工气候箱，上海新苗医疗器械制造有限公司产；UV-5500型紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司产；ZEENIT 700P型耶拿火焰石墨炉原子吸收光谱仪，德国耶拿分析仪器股份公司产。

1.2 实验设计

采用双因素随机实验设计，设置 Cd 胁迫和外源褪黑素处理2个因素。根据前期研究结果[17]，本实验Cd 胁迫设置2个水平，分别为100 μmol·L-1、200 μmol·L-1。每个Cd胁迫水平下设置4个浓度的外源褪黑素处理，分别为0 μmol·L-1、10 μmol·L-1、100 μmol·L-1、1000 μmol·L-1[18]。

取籽粒饱满、大小一致的小麦种子，用体积分数0.5%的次氯酸钠溶液浸泡30 min后，去离子水冲洗数次。将清洗后的种子浸泡在去离子水中24 h后，取出种子，用滤纸吸干表面水分，将其均匀摆放于铺有2层滤纸的直径为9 cm的培养皿中。每个培养皿中放入60粒小麦种子，每组处理设5个重复，共40个培养皿。将培养皿置于温度为25 ℃、光暗比为12 h/12 h的光照培养箱中培养，每天更换滤纸并添加同等浓度的溶液。待种子萌发15 d后测定其生长、生理及Cd含量等指标。

1.3 测定指标及方法

小麦幼苗萌发培养15 d后，测量小麦幼苗的根长、芽长，并测定小麦芽中超氧化物歧化酶(SOD)活性、过氧化氢酶(CAT)活性、过氧化物酶(POD)活性和丙二醛(MDA)含量。SOD、CAT、POD活性和MDA含量分别采用氮蓝四唑、高锰酸钾滴定法、愈创木酚法和硫代巴比妥酸法测定[19]。

将小麦幼苗根和芽分离，用超纯水洗净，在温度为80 ℃的烘箱中烘干后用研钵磨碎。样品经过消解和赶酸处理后冷却至室温，所得溶液定容于25 mL锥形瓶中，过滤后用石墨炉原子吸收法测定根和芽中的Cd含量。相应指标的计算公式如下：

小麦根对Cd的滞留率=

1.4 数据处理

采用SPSS 16.0统计分析软件进行数据分析和显著性差异检验。数据以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 外源褪黑素对Cd胁迫下小麦幼苗生长指标的影响

外源褪黑素对Cd胁迫下小麦幼苗生长的影响如图1所示(同一折线上不同字母表示在0.05水平上有显著性差异(P<0.05)；同一折线上相同字母表示在0.05水平上无显著性差(P<0.05)，下同)。由图1可知，当Cd浓度为100 μmol·L-1时，相对于褪黑素浓度0 μmol·L-1，浓度为 10 μmol·L-1、100 μmol·L-1和1000 μmol·L-1的褪黑素添加分别使小麦幼苗芽长增加了17.09%、2.57%和7.30%；当Cd浓度为200 μmol·L-1时，上述浓度褪黑素的添加分别使小麦幼苗芽长增加了5.75%、21.45%和1.60%。当Cd浓度为100 μmol·L-1时，相对于褪黑素浓度0 μmol·L-1，浓度为10 μmol·L-1、100 μmol·L-1的褪黑素添加分别使小麦幼苗根长增加了12.45%、9.24%，而浓度为1000 μmol·L-1的褪黑素添加使根长降低了4.02%；当Cd浓度为200 μmol·L-1时，上述浓度褪黑素的添加分别使小麦幼苗根长增加了17.41%、19.58%和17.09%。整体来看，不同浓度Cd胁迫下，低浓度褪黑素能显著促进小麦幼苗芽和根的生长。前期研究[17]发现，在Cd 胁迫下，小麦芽和根的生长明显受到抑制。本研究结果则显示，随着褪黑素浓度的增加，小麦幼苗根长和芽长均呈现先增加后降低的趋势，说明适量的褪黑素能缓解Cd胁迫对小麦幼苗生长的影响，而超过一定浓度的褪黑素对Cd胁迫下小麦幼苗生长起抑制作用，这与刘仕翔等[20]和李冬等[21]关于外源褪黑素对Cd胁迫下水稻及豌豆生长的影响研究结果一致。这说明在Cd胁迫下，适宜浓度的外源褪黑素可以提高植物对Cd胁迫的抗逆性，缓解Cd对小麦幼苗的毒害作用，而高浓度褪黑素可能抑制了小麦体内吲哚乙酸的合成，并通过钙调蛋白引起微管蛋白的解聚，破坏了细胞的纺锤体结构进而影响了小麦幼苗的生长[22]。

图1 外源褪黑素对 Cd 胁迫下小麦幼苗生长的影响

2.2 外源褪黑素对Cd胁迫下小麦幼苗生理指标的影响

外源褪黑素对 Cd 胁迫下小麦幼苗生理指标的影响如图2所示。由图2a)可见，在Cd胁迫下，小麦幼苗的SOD活性随着褪黑素浓度的增加呈先增加后下降的趋势。在100 μmol·L-1Cd 胁迫下，与浓度0 μmol·L-1褪黑素相比，10 μmol·L-1和100 μmol·L-1褪黑素的添加分别使小麦幼苗的SOD 活性上升了7.14%和13.3%，而1000 μmol·L-1褪黑素的添加使SOD活性下降了2.79%；在200 μmol·L-1Cd胁迫下，10 μmol·L-1褪黑素的添加使小麦幼苗SOD活性上升了2.39%，但100 μmol·L-1和1000 μmol·L-1褪黑素的添加分别使SOD活性下降了5.97%和1.48%。由图2b)和2c)可知，在Cd 胁迫下，小麦幼苗的CAT活性亦随着褪黑素浓度的增加呈先增加后下降的趋势，且褪黑素的添加能提高Cd胁迫下小麦幼苗的POD活性。由此可见，在Cd胁迫下，一定浓度的褪黑素可提高SOD、CAT和POD的活性，这说明植物在Cd胁迫下抗氧化系统会受损，植物体内酶促防御系统的重要保护酶(SOD、CAT等)的活性会降低，而适量的褪黑素则能提高逆境胁迫下植物体内的活性氧清除能力[23]。这与M.M.Posmuk等[24]在研究不同浓度褪黑素处理对紫甘蓝在Cu胁迫下种子萌发的影响时所得结论一致，说明褪黑素具有明显的剂量效应，低浓度褪黑素可显著提高小麦幼苗抗Cd胁迫。

有研究[25-26]发现，MDA含量的高低常用来反映细胞膜损伤程度和植物抗逆性强弱。由图2d)可见，在Cd胁迫下小麦幼苗的MDA含量随着褪黑素浓度的增加呈先增加后下降的趋势。在100 μmol·L-1Cd胁迫下，相对于0 μmol·L-1褪黑素，添加 10 μmol·L-1褪黑素的小麦幼苗MDA含量提高了10.30%，添加100 μmol·L-1和1000 μmol·L-1褪黑素的小麦幼苗MDA含量分别降低了10.50%和43.00%；在200 μmol·L-1Cd胁迫下，添加 10 μmol·L-1、100 μmol·L-1和1000 μmol·L-1褪黑素的小麦幼苗MDA含量分别比0 μmol·L-1褪黑素处理提高了0.58%、21.84%和10.03%。由此可见，在低浓度Cd胁迫下，随着褪黑素浓度的升高小麦幼苗MDA含量有所降低，这与刘仕翔等[20]研究结果一致，说明褪黑素可有效缓解小麦体内的过氧化胁迫，从而提高小麦幼苗对Cd胁迫的抵抗能力。在高浓度Cd 胁迫下，较高浓度外源褪黑素的添加反而使MDA含量增加，进一步表明高浓度褪黑素可能成为限制小麦幼苗生长的一个胁迫因子，增加的MDA通过与小麦幼苗蛋白质发生反应使其变性，导致膜流动性降低，进而影响小麦幼苗的生长[25-26]。

图2 外源褪黑素对 Cd 胁迫下小麦幼苗生理指标的影响

2.3 外源褪黑素对Cd胁迫下小麦幼苗Cd含量的影响

外源褪黑素对Cd胁迫下小麦幼苗根和芽中Cd含量的影响如表1所示。由表1可见，外源褪黑素的添加显著降低了小麦幼苗中的Cd含量。Cd胁迫浓度为100 μmol·L-1时，与0 μmol·L-1褪黑素相比，添加 10 μmol·L-1、100 μmol·L-1、1000 μmol·L-1褪黑素分别使小麦幼苗根部Cd含量降低了56.00%、68.00%和28.00%，小麦芽中Cd含量分别降低了55.89%、32.35%和55.88%；当Cd 浓度为200 μmol·L-1时，上述浓度的褪黑素分别使小麦幼苗根部Cd含量降低了93.70%、65.20%和66.06%，小麦芽中Cd含量分别降低了33.33%、77.78%和70.37%。当Cd浓度为100 μmol·L-1时，与0 μmol·L-1褪黑素相比，添加10 μmol·L-1和100 μmol·L-1褪黑素后，Cd在小麦幼苗中的转移系数增加显著，Cd在根系中的滞留率相应降低；添加1000 μmol·L-1褪黑素后，转移系数降低，滞留率则增加。当Cd浓度为200 μmol·L-1，添加不同浓度褪黑素后Cd的转移系数均比Cd浓度为100 μmol·L-1时小，在根系中滞留率则相应较大。由此可见，在Cd胁迫下，添加不同浓度的褪黑素均可显著降低小麦中Cd的含量，且随着外源褪黑素的增加，小麦中的Cd含量呈现先下降后上升的趋势，说明较低浓度的褪黑素在一定程度上显著抑制了小麦对Cd的吸收，这与以往研究结果一致[22，27-28]。此外，本研究发现在Cd浓度为100 μmol·L-1时，较高浓度外源褪黑素(100 μmol·L-1、1000 μmol·L-1)的添加不仅显著降低了小麦幼苗中的Cd含量，而且显著增加了Cd在小麦中的转移系数，致使根中Cd的滞留量减少，而Cd浓度为200 μmol·L-1时，较高浓度外源褪黑素对100 μmol·L-1、1000 μmol·L-1Cd在小麦中的转移影响并不显著。以上结果说明，外源褪黑素在降低小麦Cd吸收量的同时，一定程度上也促进了Cd在小麦中的转移，这可能与褪黑素能够影响植物装载转运Cd元素的相关基因转录水平有关[29]，还有待于进一步研究。

表1 外源褪黑素对 Cd 胁迫下小麦幼苗根和芽中Cd含量的影响

3 结论

本文通过室内培养实验分析了外源褪黑素对Cd胁迫下小麦幼苗生长生理特征及Cd含量的影响，结果表明：1)适量的褪黑素能有效缓解 Cd 胁迫对小麦根长和芽长的抑制，促进小麦幼苗生长；2)低浓度褪黑素可通过影响小麦幼苗中SOD、CAT和 POD 活性来提高小麦幼苗对Cd胁迫的抵抗力，且低浓度褪黑素对Cd胁迫下小麦体内的过氧化胁迫有缓解作用，而较高浓度褪黑素使得高浓度Cd胁迫下小麦幼苗的MDA含量增加，说明较高浓度褪黑素可能是限制小麦幼苗生长的胁迫因子；3)褪黑素在一定程度上通过抑制小麦对Cd的吸收来降低小麦幼苗中的Cd含量，且低浓度褪黑素可促进Cd在小麦中的转移。以上结果，一方面体现了低浓度外源褪黑素能够提高小麦对Cd胁迫的抵抗力，另一方面为探索有效改善作物在Cd胁迫下如何稳定生长提供了新思路，这也将是后期开展研究的重点。