纺织品中7种异噻唑啉酮类抗菌剂的同时测定

林君峰，王成云，白 爽，李成发，李丽霞，谢堂堂

（1.深圳市检验检疫科学研究院，广东深圳 518010；2.深圳海关工业品检测技术中心，广东深圳 518067）

在纺织工业中，为了提高纺织品的抗菌性能，常使用抗菌剂进行抗菌整理。异噻唑啉酮是一类常用的抗菌整理剂，经其整理后，纺织品的抗菌性能得到极大提升［1-6］。例如，丝绸经异噻唑啉酮类抗菌剂整理后，抗菌性能得到极大改善。但是，部分异噻唑啉酮具有接触致敏性，与皮肤接触后会引发接触性皮炎［7-16］；部分异噻唑啉酮具有细胞毒性和神经毒性，会损害人体和鱼类的生殖系统［17-19］；职业性接触异噻唑啉酮还可能导致中毒性肝病死亡［20］。因此各国纷纷立法限制其使用［21-23］，且限制使用的该类抗菌剂种类不断增加。目前共有7 种异噻唑啉酮被列入管制目录：2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮（MI）、2-丁基-1,2-苯并异噻唑啉-3-酮（BBIT）、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮（CMI）、2-正辛基-4-异噻唑啉-3-酮（OI）、2-甲基-1,2-苯并异噻唑啉-3-酮（MBIT）、1,2-苯并异噻唑啉-3-酮（BIT）、4,5-二氯-2-正辛基-4-异噻唑啉-3-酮（DCOI）。纺织品、皮革、化妆品、涂料等样品中的异噻唑啉酮类抗菌剂检测已有大量文献报道［24-34］，但测定对象均未完全涵盖全部7 种限用异噻唑啉酮，建立的方法不能直接用于同时测定全部7 种限用异噻唑啉酮类抗菌剂。本实验采用超声萃取技术提取纺织品中的异噻唑啉酮，提取产物经处理后进行UPLC/MS-MS 分析，从而建立气质联用分析方法，能同时测定7 种异噻唑啉酮类抗菌剂。采用该方法对256 个市售纺织品进行测试，结果在6 个样品中检出OI，质量分数为336～10 169 mg/kg。

1 实验

1.1 材料与仪器

织物：1#梭织真丝连衣裙、2#针织真丝女式长袖套头衫、3#纯棉女式短袖衬衫、4#平纹机织染色女式棉上衣、5#梭织亚麻女式长袖衬衫、6#梭织亚麻男式衬衫（6个阳性样品中均被检出含有OI［6］，市售）。

试剂：4,5-二氯-2-正辛基-4-异噻唑啉-3-酮（DCOI，99.8%，日本东京化成株式会社），2-正辛基-4-异噻唑啉-3-酮（OI，99.9%）、1,2-苯并异噻唑啉-3-酮（BIT，99.2%）、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮（MI，99.5%）（美国Sigma-Aldrich 公司），2-甲基-1,2-苯并异噻唑啉-3-酮（MBIT，98.0%）、2-丁基-1,2-苯并异噻唑啉-3-酮（BBIT，95.0%）、5-氯-2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮（CMI，99.0%）（德国Dr.Enrenstorfer GmbH公司），甲醇（色谱纯，美国Fisher Scientific 公司）。

仪器：QYB-3 自动制样机（中山市启元机械科技有限公司），AS3120 超声波清洗器（美国Auto Science公司），RE-52AA 旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），EVA50 氮吹仪（北京普力泰科仪器有限公司），0.45 μm 滤膜（天津市津腾实验设备有限公司），6495 Triple Quad UPLC/MS-MS 超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪（美国Agilent公司）。

1.2 混合标准工作溶液的配制

用甲醇配制混合标准储备液（各组分质量浓度均为200 μg/L），用甲醇逐级稀释至各组分质量浓度为100.0、40.0、20.0、10.0、4.0、2.0、1.0、0.4、0.2 μg/L，得到系列质量浓度的混合标准工作溶液。

1.3 样品前处理

样品前处理参照文献［6，34］进行：将待测样品切割成5 mm×5 mm 的小块，混匀，称取约1 g 样品放入35 mL 玻璃反应瓶中，加入20 mL 甲醇，在45 ℃下超声萃取20min，过滤，滤液收集到200 mL 鸡心瓶中；残渣用20 mL 甲醇再次进行超声萃取，合并萃取液。在旋转蒸发仪中将萃取液于真空下旋转蒸发至近干，再转移至氮吹仪中用干燥氮气缓慢吹干［6，35-38］。用1 mL 甲醇溶解残留物，所得溶液用0.45 μm 滤膜过滤，滤液供测试用。

1.4 测试

UPLC/MS-MS：采用超高效液相色谱-三重四极杆串联质谱仪进行测试。

2 结果与讨论

2.1 超声萃取条件的优化

影响超声萃取效率的因素主要有萃取溶剂种类及体积、萃取方式、萃取时间、萃取温度［6，36-39］。首先以甲醇作为萃取溶剂，单独考察萃取时间、萃取溶剂体积、萃取温度对萃取量的影响（对6 个阳性样品各超声萃取1 次，观察每个样品的萃取量和总萃取量变化）。由表1～表3 可知，萃取量和总萃取量均随着萃取时间的延长、萃取溶剂体积的增加、萃取温度的升高而提升并达到最大值；达到最大值后，继续延长萃取时间、增加萃取溶剂体积和升高萃取温度，萃取量反而下降。萃取时间、萃取溶剂体积、萃取温度同时影响萃取量和总萃取量，可通过正交实验来考察其综合影响。表4 为3 因素3 水平正交实验的9 个实验条件，在给定的萃取条件下，选择甲醇作为萃取溶剂进行1 次超声萃取，6 个阳性样品的萃取量和总萃取量也列于其中。针对6 个阳性样品，根据表4 中的萃取量数据分别计算萃取时间A、萃取溶剂体积B、萃取温度C的k值、R值，以确定优化方案。5#、6#样品的优化方案分别为A2B2C1、A3B2C3，其余4 个样品和总萃取量的优化方案均为A2B2C3。综合考虑，最终确定的优化方案为A2B2C3。在此条件下，以甲醇作为萃取溶剂，对6 个阳性样品进行连续3 次超声萃取，计算总萃取量和每次萃取量占总萃取量的百分比。实验结果表明，对于1#、2#、3#、4#、5#、6#样品，第1 次萃取量分别占总萃取量的91.86%、93.17%、94.57%、92.68%、95.83%、93.42%，第2 次萃取量分别占总萃取量的8.14%、6.83%、5.43%、7.32%、4.17%、6.58%，第3 次萃取时均未检出OI。因此采用连续2次超声萃取的方式提取纺织品中的异噻唑啉酮类抗菌剂。

表1 萃取量随萃取时间的变化

表2 萃取量随萃取溶剂体积的变化

表3 萃取量随萃取温度的变化

表4 超声萃取正交实验表

在上述萃取条件下，分别以表5 中所列出的11种常见溶剂作为萃取溶剂［37］，超声萃取6 个阳性样品中的OI。实验结果表明，对于6个阳性样品，甲醇的萃取量均最大。因此，超声萃取条件最终确定以甲醇作为萃取溶剂，进行连续2 次超声萃取，萃取温度45 ℃，萃取时间20 min，萃取溶剂体积20 mL。

表5 不同溶剂的萃取效果

2.2 分析条件的优化

2.2.1 质谱条件

进行质谱分析时，毛细管电压为+3 500 V，碰撞气为高纯氮气（纯度大于99.999%），鞘气和吹扫气均为氮气，流速均为11 L/min，鞘气和吹扫气温度分别为350、250 ℃。在此条件下，对各组分质量浓度均为200 mg/L 的混合标准工作溶液进行分析。根据化合物的分子结构可知，异噻唑啉酮类抗菌剂在正离子模式下有比较好的响应，而且经过ESI 电离生成的特征分子离子峰均为［M+H］+，将其选为母离子峰，确定MI、CMI、BIT、MBIT、BBIT、OI 和DCOI 的准分子离子（母离子）分别为m/z=116.02、149.98、152.02、166.03、208.08、214.13、282.05。在碰撞电压分别为10、30、50、70 V 条件下，用高纯氮气对上述母离子进行碰撞产生碎片离子。母离子与其产生的1 个子离子可以组成1个离子对。对于每个母离子，均选择丰度较高的4个离子对，利用Optimizer 优化软件进一步细致优化碰撞能量。细致优化时，碰撞能量从1 V 逐渐增大至79 V，增长步长为2 V。观察不同碰撞能量下各离子对的丰度变化，丰度最大时的电压就是优化后的碰撞能量。各离子对的驻留时间由仪器根据保留时间（tR）以及保留时间变化范围（ΔtR）自动计算，池加速电压均为2 V，优化后的参数见表6。

表6 7 种异噻唑啉酮类抗菌剂的动态MRM 条件

2.2.2 色谱条件

异噻唑啉酮类化合物都属于极性比较强的化合物，因此本实验采用C18类型的色谱柱对其进行分离，比较不同型号的C18色谱柱的分离效果，最终采用Zorbax Eclipse Plus C18色谱柱（100.0 mm×2.1 mm×1.8 μm）进行色谱分离。在确定色谱柱后，分别考察甲醇/水溶液流动相和乙腈/水溶液流动相的分离效果。结果表明，采用乙腈/水溶液作为流动相时基线平稳，谱峰峰形较好，峰面积和保留时间的重复性较好。为进一步改善质谱信号响应，分别在水相中添加0.1%甲酸、0.01 mol/L 乙酸铵。结果表明，当添加0.1%甲酸时，色谱峰之间能够完全分离，而且响应也比较高。因此，最终选择的流动相为乙腈/水溶液（含0.1%甲酸）。在此流动相下，改变流速、柱温、洗脱梯度，观察不同色谱条件下各组分的分离效果。结果发现，当柱温较高时，柱压明显下降，但分离度也下降；流速较大时，各目标分析物的保留时间变短，谱峰峰形变窄，柱压上升，分离度下降［40］。色谱分离条件最终优化为：色谱柱为Zorbax Eclipse Plus C18（100.0 mm×2.1 mm×1.8 μm）；流动相A 为水（含0.1%甲酸），B为乙腈；当洗脱梯度为0 min 时，流动相为90%A/10%B，8.00 min 时线性递变为10%A/90%B 并保持至9.00 min，9.01 min 时流动相变为90%A/10%B 并保持至12.00 min；流速为0.5 mL/min；柱温为40 ℃。

在2.2 的条件下对7 种异噻唑啉酮类抗菌剂混合标准溶液进行分析，得到的UPLC/MS-MS 图如图1 所示。图1 中，各组分的谱峰之间完全分离，谱峰峰形尖锐，对称性好。

图1 混合标准溶液的UPLC/MS-MS 图

2.3 方法的回收率与精密度

回收率和精密度实验见表7。

表7 回收率和精密度实验

以不含目标分析物的衬布作为空白样品，采用空白样品加标回收的方法来确定方法的回收率和精密度［41］，所用衬布分别为白棉衬布、亚麻衬布、真丝衬布以及涤纶衬布。在空白样品中分别添加3 个不同质量分数的混合标准溶液（1.0、4.0、20.0 μg/kg），制备添加回收实验测试样［36-41］，每个质量分数水平各制备6 份平行样，按本实验建立的方法进行测试，再计算方法的加标平均回收率和相对标准偏差（RSD，n=6）［37］。由表7 可以看出，7 种目标分析物的加标平均回收率为80.25%～96.52%，相对标准偏差为3.25%～14.59%。

2.4 方法的线性关系和检出限

应用本实验建立的方法对系列质量浓度的混合标准工作溶液进行测试，确定各混合标准工作溶液中各化合物的峰面积，用峰面积对质量浓度作图［36］，结果发现，对于每种异噻唑啉酮类抗菌剂，在一定质量浓度范围内，峰面积与其质量浓度线性相关。表8给出了7 种异噻唑啉酮类抗菌剂的线性关系。按10倍信噪比（S/N=10）计算方法的定量下限（LOQs），7种异噻唑啉酮类抗菌剂的定量下限均为0.1 μg/kg。

表8 线性关系和定量下限

2.5 实际样品测试

利用本实验建立的方法对256 个市售纺织品进行测试，结果在6 个样品中检测到了OI，这6 个样品分别是梭织真丝连衣裙、针织真丝女式长袖套头衫、纯棉女式短袖衬衫、平纹机织染色女式棉上衣、梭织亚麻女式长袖衬衫以及梭织亚麻男式衬衫［6］，其中OI 的检出量分别为6 694、718、829、10 169、336、8 796 mg/kg。欧盟法规要求纺织品中OI 的质量分数不得超过10 mg/kg，这6 个样品的OI 检出量均远远超过欧盟法规允许的限量水平，应引起重视。图2 是纯棉女式短袖衬衫的UPLC/MS-MS 图，在tR=6.830 min处有1 个尖锐谱峰，该保留时间与OI 标准品的保留时间（tR=6.830 min）一致。

图2 纯棉女式短袖衬衫的UPLC/MS-MS 图

3 结论

建立了UPLC/MS-MS 分析方法，能同时测定纺织品中的7 种异噻唑啉酮类抗菌剂，该方法简便快捷，灵敏度高，定量下限低至0.1 μg/kg，远低于欧盟法规的限量水平，完全可以满足纺织品中异噻唑啉酮类抗菌剂的日常检测工作要求。应用该方法对市售纺织品进行测试，结果在部分样品中检出了OI，其质量分数为336～10 169 mg/kg，远高于欧盟允许限量水平（10 mg/kg），应引起高度重视。