高效液相色谱法同时测定景天祛斑胶囊中10种成分含量

陶莉，王玉婷

(1.武汉市第四医院药学部，武汉 430033；2.武汉大学药学院，武汉 430071)

景天祛斑胶囊由黄芪、红景天、当归、红花、珍珠、杜鹃花、制何首乌和枸杞子8味药材组方而成，用于气滞血瘀所致黄褐斑、痤疮的治疗[1]。临床研究表明，景天祛斑胶囊能显著提高血中超氧化物歧化酶抗氧化活性，增加血氧生成量，净化血液并增强其流动性，改善微循环及性激素失调所导致皮肤炎症，使皮肤微循环血液充沛、弹性增加，恢复肌肤细胞活力[2]；与谷胱甘肽联合用药可明显降低黄褐斑患者卵泡雌激素、黄体生成素和雌二醇水平，有效降低患者血清雌激素水平，对黄褐斑临床治疗效果显著[3-4]；联合点阵激光可在短期内迅速改善皮损症状，有效调节女性体内性激素平衡，疗效确切，复发率低[5-6]。中药及其制剂，尤其是多味中药材组成的复方制剂，大多数药效物质基础尚不明确，所含成分复杂多样，成分间相互协调、相互制约，现有的单指标成分质量控制模式[1，7-9]难以全面反映其整体质量，严重制约了中医药国际化和标准化的进展，依据中药质量标志物[10-11]确认原则，建立多指标成分综合评价模式近年来已逐步应用于中药复方制剂的质量评价中。本实验以君药红景天所含特征成分红景天欧素、红景天宁和大花红景天素为首选，同时兼顾臣药当归所含主要药效成分阿魏酸松柏酯、藁本内酯和欧当归内酯，佐药黄芪所含主要成分毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷和毛蕊异黄酮为定量控制指标成分，采用高效液相色谱(HPLC)梯度洗脱法对上述10种成分含量进行同时测定，并采用SPSS 26.0版统计软件对所测含量结果进行聚类分析、主成分分析等化学计量学分析，以期为景天祛斑胶囊质量控制和整体评价提供检测依据。

1 仪器与试药

1.1仪器 Waters 2695型高效液相色谱仪(美国Waters公司)；BT25S型电子分析天平(德国Sartorius公司，感量：0.01 mg)；KQ-300型超声波清洗器(江苏昆山市超声仪器有限公司)。

1.2试药 毛蕊异黄酮葡萄糖苷(批号：111920-201907，含量：96.8%)对照品来源于中国食品药品检定研究院；芒柄花苷(批号：PRF8081121，含量：99.6%)、9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷(批号：PRF8101143，含量：99.1%)、毛蕊异黄酮(批号：PRF8062601，含量：99.6%)、大花红景天素(批号：PRF9031426，含量：99.7%)和欧当归内酯(批号：PRF10021443，含量：97.7%)对照品均来源于成都普瑞法科技开发有限公司；红景天欧素(批号：CFS202001，含量：98.0%)和红景天宁(批号：CFS201802，含量：98.2%)对照品来源于武汉天植生物技术有限公司；阿魏酸松柏酯(批号：17112023，含量：94.4%)和藁本内酯(批号：17111023，含量：98.1%)对照品来源于上海同田生物技术股份有限公司。景天祛斑胶囊(规格：每粒装0.5 g，批号：06190101，06190103，06190105，06190108，06190201，06190213，06190302，06200219，06200302，06200304，编号依次为S1～S10)来源于青海晶珠藏药高新技术产业股份有限公司。乙腈为色谱纯，其他试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1色谱条件 以乙腈(A)-0.2%甲酸(B)为流动相，梯度洗脱(0～9 min，8.0%A；9～20 min，8.0%→17.0%A；20～32 min，17.0%→35.0%A；32～48 min，35.0%→64.0%A；48～55 min，64.0%→8.0%A)，流速：0.9 mL·min-1；采用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱温30 ℃；检测波长分别为254 nm(0～20 min检测毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷和毛蕊异黄酮)[12-14]、382 nm(20～32 min检测红景天欧素、红景天宁和大花红景天素)[15]和280 nm(32～55 min检测阿魏酸松柏酯、藁本内酯和欧当归内酯)[16-17]；进样量10 μL。

2.2混合对照品溶液的制备 精密称取毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、红景天欧素、红景天宁、大花红景天素、阿魏酸松柏酯、藁本内酯和欧当归内酯对照品各适量，用70%甲醇制成浓度分别为0.836，0.498，0.614，0.362，1.138，0.692，0.116，1.754，1.318和0.172 mg·mL-1的混合对照品贮备液。精密吸取贮备液1.0 mL，用70%甲醇稀释至20 mL，制成毛蕊异黄酮葡萄糖苷41.8 μg·mL-1、芒柄花苷24.9 μg·mL-1、9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷30.7 μg·mL-1、毛蕊异黄酮18.1 μg·mL-1、红景天欧素56.9 μg·mL-1、红景天宁34.6 μg·mL-1、大花红景天素5.8 μg·mL-1、阿魏酸松柏酯87.7 μg·mL-1、藁本内酯65.9 μg·mL-1、欧当归内酯8.6 μg·mL-1的混合对照品溶液。

2.3供试品溶液的制备 取景天祛斑胶囊内容物细粉2.0 g，精密称定，置25 mL量瓶中，加70%甲醇20 mL，经30 min超声处理，放凉，用70%甲醇稀释至刻度，混合均匀，滤过，即得景天祛斑胶囊供试品溶液。取按景天祛斑胶囊质量标准项下处方比例和制备工艺制备的缺黄芪、缺红景天和缺当归的3种阴性供试品各适量，按照上述方法分别制成阴性供试品溶液。

2.4系统适用性实验 精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液及“2.3”项4种溶液各10 μL，进样分析，记录色谱图(图1)。结果景天祛斑胶囊中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、红景天欧素、红景天宁、大花红景天素、阿魏酸松柏酯、藁本内酯和欧当归内酯峰形对称，拖尾因子符合《中华人民共和国药典》(2015年版)规定；理论板数按各成分色谱峰计均≥4000；被检测色谱峰与相邻色谱峰均能有效分离(分离度>1.5)；阴性供试品对景天祛斑胶囊中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、红景天欧素、红景天宁、大花红景天素、阿魏酸松柏酯、藁本内酯和欧当归内酯含量的同时测定无干扰。

1.毛蕊异黄酮葡萄糖苷；2.芒柄花苷；3.9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷；4.毛蕊异黄酮；5.红景天欧素；6.红景天宁；7.大花红景天素；8.阿魏酸松柏酯；9.藁本内酯；10.欧当归内酯。

2.5含量测定方法学验证

2.5.1线性关系考察 精密吸取“2.2”项混合对照品贮备液0.1，0.2，0.5，1.0，2.0和4.0 mL，分别用70%甲醇稀释至20 mL，制成系列混合对照品溶液，依次注入液相色谱仪，测定毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、红景天欧素、红景天宁、大花红景天素、阿魏酸松柏酯、藁本内酯和欧当归内酯的峰面积，以峰面积(Y)对质量浓度(X，μg·mL-1)进行回归，得10种成分的回归方程和线性范围(表1)。

表1 景天祛斑胶囊中10种成分的回归方程、相关系数(r)和线性范围

2.5.2精密度实验 精密吸取景天祛斑胶囊(编号：S1)同一份供试品溶液10 μL，连续进样6次，计算得毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、红景天欧素、红景天宁、大花红景天素、阿魏酸松柏酯、藁本内酯和欧当归内酯峰面积的RSD分别为1.01%，0.97%，0.82%，1.13%，0.68%，0.74%，1.21%，0.53%，0.61%和1.05%。

2.5.3重复性实验 取同一批次景天祛斑胶囊(编号：S1)，按“2.3”项方法制备供试品溶液并进样检测，平行进行6份实验，计算得毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、红景天欧素、红景天宁、大花红景天素、阿魏酸松柏酯、藁本内酯和欧当归内酯含量的RSD分别为1.33%，1.69%，1.52%，1.68%，1.29%，1.26%，1.85%，1.12%，1.41%和1.75%。

2.5.4稳定性实验 取景天祛斑胶囊(编号：S1)同一份供试品溶液，于0，2，6，12，18和24 h各进样10 μL，考察景天祛斑胶囊供试品溶液的稳定性，结果该溶液24 h内稳定，毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、红景天欧素、红景天宁、大花红景天素、阿魏酸松柏酯、藁本内酯和欧当归内酯峰面积的RSD分别为0.99%，1.02%，0.79%，1.15%，0.74%，0.66%，1.18%，0.55%，0.59%和1.06%。

2.5.5加样回收率实验 取已知毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、红景天欧素、红景天宁、大花红景天素、阿魏酸松柏酯、藁本内酯和欧当归内酯含量的景天祛斑胶囊(编号：S1)内容物细粉9份，每份1.0 g，随机平分成3组，精密称定，精密加入混合对照品溶液(毛蕊异黄酮葡萄糖苷0.297 mg·mL-1、芒柄花苷0.181 mg·mL-1、9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷0.219 mg·mL-1、毛蕊异黄酮0.126 mg·mL-1、红景天欧素0.385 mg·mL-1、红景天宁0.267 mg·mL-1、大花红景天素0.039 mg·mL-1、阿魏酸松柏酯0.657 mg·mL-1、藁本内酯0.473 mg·mL-1、欧当归内酯0.064 mg·mL-1)1.0，2.0和3.0 mL各一组，再按“2.3”项方法制成加样供试品溶液，精密吸取上述9种溶液各10 μL，进样检测毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、红景天欧素、红景天宁、大花红景天素、阿魏酸松柏酯、藁本内酯和欧当归内酯的峰面积并计算10种成分的加样回收率及RSD值(表2)。

表2 景天祛斑胶囊中10种成分的加样回收率实验结果

续表2 景天祛斑胶囊中10种成分的加样回收率实验结果

续表2 景天祛斑胶囊中10种成分的加样回收率实验结果

2.6含量测定结果 取景天祛斑胶囊样品10批，每批次分别按“2.3”项方法制备供试品溶液3份，注入高效液相色谱仪中检测毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、红景天欧素、红景天宁、大花红景天素、阿魏酸松柏酯、藁本内酯和欧当归内酯的峰面积，计算10种成分的含量(表3)。

表3 景天祛斑胶囊中10种成分含量测定结果

2.7化学计量学分析

2.7.1聚类分析 将“2.6”项景天祛斑胶囊样品含量测定结果导入SPSS 26.0版软件，采用组间联接系统聚类分析方法，以欧氏距离为测度，对10批景天祛斑胶囊样品进行聚类分析，得聚类分析树状图(图2)。由图2可知，10批景天祛斑胶囊样品聚为3类，样品S9、S10和S8聚为第Ⅰ类，样品S2、S3、S1和S4聚为第Ⅱ类，样品S6、S7和S5聚为第Ⅲ类。中药制剂不同于化学药制剂，其所用中药材因种属基源、产地来源、药材生长年限、采收时节以及原药材加工、贮藏等因素影响，直接影响产品的质量和最终疗效，从分类结果可以看出，景天祛斑胶囊中目标化合物含量差异与样品生产期间相关，同一期间生产的产品聚为一类，不同生产期间原药材的质量差异是其主要因素，重点关注原药材种属基源、产地来源等关键因素，提示药品生产企业加强原药材源头质量控制，严格控制药材的进货渠道，完善药材内控质量标准的建立，同时关注制剂生产过程的参数控制，从原药材源头和生产过程中加强产品质量稳定性控制。

图2 10批景天祛斑胶囊聚类分析树状图

2.7.2主成分分析 采用SPSS 26.0版软件对10批景天祛斑胶囊样品进行主成分分析，将“2.6”项景天祛斑胶囊样品含量测定结果导入软件，得主成分分析碎石图(图3)、特征值和方差贡献率表(表4)及成分矩阵表(表5)。以累积方差贡献率>85%、初始特征值>1为提取标准，结果前4个主成分初始特征值均>1，累积方差贡献率为86.681%，表明提取前4个主成分可代表景天祛斑胶囊10种目标化合物86.681%的信息。从表5成分矩阵结果可以看出，毛蕊异黄酮、9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、红景天欧素和芒柄花苷对主成分1贡献较大，大花红景天素、藁本内酯、红景天宁和欧当归内酯对主成分2贡献较大，阿魏酸松柏酯对主成分3贡献较大，毛蕊异黄酮葡萄糖苷对主成分4贡献较大。采用综合主成分值(F)评价各指标成分的权重，按照计算公式F=33.370F1+25.582F2+15.950F3+11.778F4(其中33.370，25.582，15.950和11.778分别为主成分1～4的方差贡献率，F1～F4分别为各目标成分中主成分1～4得分)，计算目标成分综合主成分值(表5)，结果10种目标成分综合主成分值从高至低依次为9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、大花红景天素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、藁本内酯、红景天欧素、阿魏酸松柏酯、红景天宁和欧当归内酯，建议将综合主成分值较高的指标成分9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、大花红景天素、毛蕊异黄酮葡萄糖苷纳入该制剂的质量控制标准中。

图3 主成分分析碎石图

表4 主成分特征值和方差贡献率

表5 成分矩阵表及综合主成分值

3 讨论

3.1目标成分的选择 景天祛斑胶囊中红景天、红花益气活血、散瘀止痛，共为君药；当归补血活血[18]，珍珠解毒生肌、润肤祛斑，杜鹃花和血解毒，共为臣药；黄芪补气升阳、生津养血、敛疮生肌，制何首乌、枸杞子补肝肾、益精血、化浊降脂，为佐使药。8味中药材所含成分相互协同、相互制约，共奏活血行气、祛斑消痤的临床功效。现代研究表明，红景天可有效治疗黄褐斑、痤疮、多形性日光疹等多种皮肤病[19]，具有抗氧化、抗辐射、防老化等作用，其中红景天欧素、红景天宁、大花红景天素等为其黄酮类主要活性成分；毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷和毛蕊异黄酮等黄酮类为黄芪的代表性成分，具有抗氧化、消除自由基等作用，能够有效祛斑、美白[20]；阿魏酸松柏酯、藁本内酯和欧当归内酯等为当归的代表性成分。依据中药质量标志物确认原则，选取上述10种成分作为定量控制目标成分，以期为全面评价景天祛斑胶囊整体质量，确保产品质量和临床疗效一致性提供基础数据。

3.2流动相的选择 本实验在流动相优化选择时，参考相关文献重点考察了乙腈-水[21]、甲醇-水[22-23]、乙腈-甲酸溶液[12-13，16-17]、乙腈-冰醋酸溶液流动相体系。结果显示以乙腈-甲酸溶液为流动相系统进行梯度洗脱时，基线平稳，10种目标化合物色谱峰的分离度较好。遂进一步对甲酸的浓度(0.1%甲酸[15，17，23]，0.2%甲酸[13，16]和0.3%甲酸[12])以及有机相与水相的洗脱比例进行了优化，最终优化出乙腈-0.2%甲酸溶液为流动相，按“2.1”项洗脱比例进行梯度洗脱，同时检测景天祛斑胶囊中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、红景天欧素、红景天宁、大花红景天素、阿魏酸松柏酯、藁本内酯和欧当归内酯含量。

笔者在本实验采用HPLC法对景天祛斑胶囊中毛蕊异黄酮葡萄糖苷、芒柄花苷、9，10-二甲氧基紫檀烷-3-O-β-D-葡萄糖苷、毛蕊异黄酮、红景天欧素、红景天宁、大花红景天素、阿魏酸松柏酯、藁本内酯和欧当归内酯含量进行了同时测定，建立了该制剂高效快速的多指标成分质量控制模式，同时对含量测定结果进行了聚类分析、主成分分析等化学计量学方法分析。本文所建立的测定方法操作简便，结果准确、可靠，重复性好，为景天祛斑胶囊多指标成分定量控制提供了实验依据。从检测结果可以看出，定量测定目标成分含量存在着一定批间差异，差异有统计学意义，表明建立景天祛斑胶囊多指标成分控制方法对稳定产品质量具有重要意义。从聚类分析和主成分分析结果来看，景天祛斑胶囊中目标成分含量差异与该制剂的生产期间相关，提出了引起产品质量差异的可能因素，明确了重点关注的目标成分，为药品生产企业和监管部门进一步完善该制剂质量控制措施，最终达到产品质量和临床疗效的稳定性提供了参考依据。