鲢鱼感染嗜水气单胞菌FAH5后免疫因子的变化研究

余文杰，谢建华

(漳州职业技术学院食品工程学院，福建漳州 363000)

鲢鱼属于鲤形目的鲤科，体侧扁平，腹部大。鲢鱼肉质柔软细腻，富含蛋白质、维生素、矿物质和氨基酸，对人体营养价值较高，特别适合小孩、孕妇食用。鲢鱼作为滤食性淡水生物，食用浮游生物和硅藻及其衍生物、动植物碎屑等。目前福建省漳州地区和漳浦地区形成了较大规模的养殖基地和养殖场。但是养殖场为了获得较大的经济效益，采用高密度养殖和高蛋白饵料投食，使得鲢鱼的水生环境恶化，引起鲢鱼传染性疾病经常暴发，养殖场为了防治这些传染性疾病耗费了大量的人力物力和财力。实验室前期研究发现，这些传染病的源头主要是嗜水气单胞菌FAH5的感染。嗜水气单胞菌是隶属于气单胞菌科和气单胞菌属的革兰阴性菌，存在于水体环境中。嗜水气单胞菌会使得水生生物产生气单胞菌败血症和溶血病。嗜水气单胞菌体内存在的溶血素和气溶素会引发寄主细胞破裂，细胞内容物分散出来，最终导致其死亡。鲢鱼血液铁元素可以和蛋白质合成载铁血红蛋白，主要功能是输送氧气和二氧化碳。同样鲢鱼体内铁元素参与免疫系统发挥积极有效作用，可以增加巨噬细胞的杀菌作用。但是铁元素也是病原体的生长元素，使得病原体生长迅速。所以，水产动物鲢鱼可以通过调节铁元素相关基因的表达过程来控制血液铁浓度和载铁蛋白浓度，从而抑制和拮抗外来病原体的生长。铁调素蛋白可以由20基因表达得到，在鲢鱼肝细胞产生，具有很强的抑菌活性。铁调素蛋白的含量高低与鲢鱼体内的铁元素浓度有密切关系。白细胞介素-1由-1基因编码，可以调节免疫细胞，有助于激活蛋白酪氨酸激酶和应激因子信号通路，可以增加铁调素基因表达，促进铁调素成熟和发挥生物学功能，达到机体免疫的基本目的。该研究通过检测健康鲢鱼感染嗜水气单胞菌FAH5后，分析鲢鱼机体血液铁浓度、血液载铁蛋白浓度和肝脏铁浓度的变化，以及鲢鱼肝脏中20、-1、1和1基因表达变化情况，从而探讨溶血性嗜水气单胞菌FAH5感染鲢鱼对免疫因子的变化情况，获得水生生物鲢鱼铁元素相关基因和铁元素浓度在感染嗜水气单胞菌FAH5过程中的作用机制。

1 材料与方法

健康鲢鱼从福建省淡水水产研究所鲢鱼养殖基地购买得到，健康鲢鱼幼体外表光亮、整洁、活动灵活、反应灵敏。获得的幼鱼重量是(80±10)g，长度是(18±2)cm。按照试验目的将健康鲢鱼随机分成试验组和对照组，每组设定3个平行，每个平行有50尾鲢鱼，总共300尾。

将前期分离得到的感染活性嗜水气单胞菌FAH5采用琼脂富集培养基进行培养，30 ℃培养24 h。培养至对数期后，使用0.65%无菌生理盐水将培养菌稀释成5.0×10CFU/mL，然后使用一次性注射针吸取0.1 mL菌体腹腔注射试验组鲢鱼。对照组鲢鱼腹腔注射0.1 mL 0.65%无菌生理盐水。试验处理后12、24、36、48、60、72、84、96和108 h作为试验点，收集每个平行中的3尾鲢鱼。收集得到鲢鱼尾部静脉血0.5～0.6 mL，血液中加肝素钠防止凝集，并保存在4 ℃冰箱备用。抽血完成后鲢鱼超净工作台中解剖，得到肝脏保存在-80 ℃冰箱中备用。

血液铁浓度和载铁蛋白浓度的测定是采用供应商的血液铁浓度和载铁蛋白浓度检测试剂盒(上海瑞楚生物科技有限公司)进行。该试验使用紫外分光光度计(UV-1800，上海清华科学仪器有限公司)对样本进行重复测定3次，取其平均值作为试验结果。

该试验采用干法消化的技术测定肝脏铁元素浓度。鲢鱼肝脏解冻后，采用无菌生理盐水清洗3次，采用滤纸吸干表面水分，并称重，然后放入坩埚中，使用马弗炉600 ℃灼烧约5 h，直到样品呈现白色或灰白色。最后自然冷却至室温，灼烧后样品再加入1∶1的硝酸水溶液5 mL，电炉消化至沸腾，滤纸过滤消化液后移入容量瓶，使用双蒸水多次冲洗坩埚，滤纸过滤后移入容量瓶，使用双蒸水定容至50 mL。使用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-1200，北京吉田仪器有限公司)对样本重复测定3次，取其平均值作为试验结果。

通过NCBI数据库设计鲢鱼20基因cDNA序列、-1基因cDNA序列、1基因cDNA序列和1基因cDNA序列引物，具体引物序列见表1。而后采用RNAiso plus total RNA提取试剂盒(宝生物工程大连有限公司)获取鲢鱼肝脏总RNA，反转录制备cDNA，使用实时荧光定量仪(RTQ-960 pro，艾康生物技术杭州有限公司)对这4种基因进行分析。这4种基因的相对表达量使用鲢鱼18S rRNA基因表达量为对照。QR-PCR扩增反应溶液：10倍PCR缓冲液5.0 μL、dNTP混合液3.0 μL、正向引物0.5 μL、反向引物0.5 μL、cDNA模板2.0 μL、酶0.5 μL，ddHO补足终体积30.0 μL。QR-PCR扩增条件：预变性93 ℃，3 min；90 ℃变性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，30个循环；最后72 ℃延伸10 min。每个样本进行重复性试验平行检测3次。

表1 鲢鱼肝脏铁元素相关基因QR-PCR引物序列

所有获得的数据使用SPSS 18.0软件进行分析，采用检验分析差异显著性。所有数据均表示为平均值±标准差。

2 结果与分析

鲢鱼受到嗜水气单胞菌FAH5感染后12～108 h时血液铁浓度的变化情况见图1。鲢鱼受到嗜水气单胞菌FAH5感染后12～108 h时，试验组相比较对照组，血液铁浓度均出现降低，其中在24和36 h时达到显著差异(<0.05)。

注：*表示差异显著(P<0.05)Note：* means significant difference(P<0.05)图1 鲢鱼受到嗜水气单胞菌FAH5感染后12～108 h血液铁浓度的变化Fig.1 Changes of blood iron concentration in Silver carp at 12-108 h after infection with Aeromonas hydrophila FAH5

鲢鱼受到嗜水气单胞菌FAH5感染后12～108 h血液载铁蛋白浓度的变化情况见图2。鲢鱼受到嗜水气单胞菌FAH5感染后12～108 h时，试验组相比较对照组，血液载铁蛋白浓度均出现上升，但均未达到显著差异(>0.05)。

图2 鲢鱼受到嗜水气单胞菌FAH5感染后12～108 h血液载铁蛋白浓度的变化Fig.2 Changes of blood ferritin concentration in Silver carp at 12-108 h after infection with Aeromonas hydrophila FAH5

鲢鱼受到嗜水气单胞菌FAH5感染后12～108 h肝脏铁浓度的变化情况见图3。鲢鱼受到嗜水气单胞菌FAH5感染后12～108 h时，试验组相比较对照组，肝脏铁浓度均出现上升，但均未达到显著差异(>0.05)。

图3 鲢鱼受到嗜水气单胞菌FAH5感染后12～108 h肝脏铁浓度的变化Fig.3 Changes of liver iron concentration in Silver carp at 12-108 h after infection with Aeromonas hydrophila FAH5

鲢鱼受到嗜水气单胞菌FAH5感染后12～108 h肝脏20基因表达的变化情况见图4。鲢鱼受到嗜水气单胞菌FAH5感染后12～108 h时，试验组相比较对照组，肝脏20基因表达量均出现增加，在12和24 h时达到显著差异(<0.05)。

注：*表示差异显著(P<0.05)Note：* means significant difference(P<0.05)图4 鲢鱼受到嗜水气单胞菌FAH5感染后12～108 h肝脏hepc20基因表达的变化Fig.4 Changes of liver hepc20 gene expression in Silver carp at 12-108 h after infection with Aeromonas hydrophila FAH5

鲢鱼受到嗜水气单胞菌FAH5感染后12～108 h肝脏-1基因表达的变化情况见图5。鲢鱼受到嗜水气单胞菌FAH5感染后12～108 h时，试验组相比较对照组，肝脏-1基因表达量均出现增加，在24和36 h时达到显著差异(<0.05)。

注：*表示差异显著(P<0.05)Note：* means significant difference(P<0.05)图5 鲢鱼受到嗜水气单胞菌FAH5感染后12～108 h肝脏il-1基因表达的变化Fig.5 Changes of liver il-1 gene expression in Silver carp at 12-108 h after infection with Aeromonas hydrophila FAH5

鲢鱼受到嗜水气单胞菌FAH5感染后12～108 h肝脏1基因表达的变化情况见图6。鲢鱼受到嗜水气单胞菌FAH5感染后12～108 h时，试验组相比较对照组，肝脏1基因表达量均出现增加，在12和24 h时达到显著差异(<0.05)。

注：*表示差异显著(P<0.05)Note：* means significant difference(P<0.05)图6 鲢鱼受到嗜水气单胞菌FAH5感染后12～108 h肝脏jak1基因表达的变化Fig.6 Changes of liver jak1 gene expression in Silver carp at 12-108 h after infection with Aeromonas hydrophila FAH5

鲢鱼受到嗜水气单胞菌FAH5感染后12～108 h肝脏1基因表达的变化情况见图7。鲢鱼受到嗜水气单胞菌FAH5感染后12～108 h时，试验组相比较对照组，肝脏1基因表达量均出现增加，在12和24 h时达到显著差异(<0.05)。

注：*表示差异显著(P<0.05)Note：* means significant difference(P<0.05)图7 鲢鱼受到嗜水气单胞菌FAH5感染后12～108 h肝脏stat1基因表达的变化Fig.7 Changes of liver stat1 gene expression in Silver carp at 12-108 h after infection with Aeromonas hydrophila FAH5

3 讨论

鲢鱼体内的铁元素可以合成机体多种活性酶，发挥免疫学功能，增加巨噬细胞的杀菌能力。同时会生成铁合血红蛋白，功能是输送氧气和二氧化碳。与此同时，铁元素作为病原体生长必需元素，可以增加其生长速度和生长数量。病原体和鲢鱼水生生物存在相互竞争关系，使得鲢鱼铁元素相关基因产生积极调节，可以减少体内血液铁浓度，增加血液载铁蛋白浓度，进而可以减少病原体的生长速度和生长数量，降低病原体的危害程度。该研究开展了鲢鱼血液铁浓度和血液载铁蛋白浓度的比较试验，鲢鱼在受到嗜水气单胞菌FAH5感染后，鲢鱼血液铁浓度开始减少，24、36 h时达到显著差异；鲢鱼肝脏铁浓度出现上升，但是均未达到显著差异。说明鲢鱼受到病原体感染后，通过自身免疫调节，降低机体铁元素循环，进而抑制病原体的生长。鲢鱼受到病原体感染后，血液载铁蛋白浓度出现上升，但均未达到显著差异。血液铁浓度和载铁蛋白浓度的比值会出现明显下降，从而减少嗜水气单胞菌FAH5生长所需的铁元素，自然就会降低病原体的生长速度和生长数量。

鲢鱼体内存在铁元素代谢相关基因，鲢鱼受到嗜水气单胞菌FAH5感染后，机体内肝脏组织的20、-1、1和1基因表达量出现明显上升，证实相关基因有助于提升鲢鱼机体免疫反应，达到免疫调节的目的，进而调节机体内的铁元素浓度。20铁调素基因的表达产物抑制肠道铁元素的吸收，抑制肝脏铁元素的释放，增加血液载铁蛋白浓度，进而降低血液铁浓度。众多研究也证实了这个现象，鲫鱼受到嗜水气单胞菌感染后，肝脏、脾脏、鳃体组织器官的20基因的表达量会出现明显上升；草鱼受到链球菌感染后，肝脏组织20基因转录产生的mRNA水平会出现明显上升；鳗鱼受到鳗利斯顿氏菌感染后，肝脏组织20基因表达量会出现明显上升。该研究结果与前人基本一致，20基因在受到嗜水气单胞菌FAH5感染后，表达量出现上升，12、24 h时具有显著差异。鲢鱼受到嗜水气单胞菌FAH5感染后，免疫细胞也会通过调控-1基因表达量，合成和分泌白细胞介素-1，感染程度与其浓度关系紧密。白细胞介素-1通过免疫反应过程调控20基因的表达量，也会调节鲢鱼铁元素浓度。-1白细胞介素结合免疫因子受体后可以调控1基因，从而可以调控1基因，最后调节20基因的表达量。该研究结果发现，鲢鱼受到嗜水气单胞菌FAH5感染后，肝脏组织-1基因表达量出现上升，24、36 h时达到显著差异(<0.05)。肝脏组织1基因的表达量出现上升，12、24 h时达到显著差异(<0.05)。肝脏组织1基因的表达量出现上升，12、24 h时达到显著差异(<0.05)。这些研究结果证实，鲢鱼受到嗜水气单胞菌FAH5感染后，其机体会快速产生免疫反应，-1基因的表达影响到1和1基因的表达，然后影响到20基因的表达量，从而调节水生生物铁元素浓度，使得病原体生长速度和生长数量降低，降低其危害程度。

4 结论

健康鲢鱼受到嗜水气单胞菌FAH5感染不同时间后，鲢鱼血液铁浓度出现不同程度的降低，其中24和36 h时与对照组比较，达到显著差异；血液载铁蛋白浓度与对照组比较，出现不同程度上升，但均未达到显著差异；肝脏铁浓度与对照组比较，出现不同程度上升，但均未达到显著差异。肝脏中20铁调素基因的表达量均出现增加，在12和24 h时与对照组比较达到显著差异；肝脏中-1白细胞介素基因的表达量均出现增加，在24和36 h时与对照组比较达到显著差异；肝脏中酪氨酸激酶1基因的表达量均出现增加，在12和24 h时与对照组比较达到显著差异；肝脏中1应激因子基因的表达量均出现增加，在12和24 h时与对照组比较达到显著差异。因此，鲢鱼机体通过调节铁调素基因20、白细胞介素基因-1、酪氨酸激酶基因1、应激因子基因1等免疫基因的表达的变化，降低机体游离铁浓度和增加储存铁浓度来应对嗜水气单胞菌FAH5的感染。