基于科学事实的PCR科学史重构

颜廷喜 郭枫方 刘 露 程可昕 陈明林

（安徽师范大学安徽省重要生物资源与利用重点实验室 安徽芜湖 241000）

《普通高中生物课程标准（实验稿）》在教学建议中提出“注重生物科学史的学习”，《普通高中生物学课程标准（2017年版2020年修订）》（以下简称《新课标》）中再次提到“注重生物科学史和生物本质的学习”。高中生物学课程不仅要求学生掌握基础的生物学知识和基本的生物学能力，还要让学生领悟科学家在研究过程中的思路和方法。学习生物学科学史能让学生沿着科学家前进的脚步，理解科学的本质和科学研究的思路和方法，促进生物学学科核心素养的形成。因此，教师要充分挖掘生物学科学史，对科学史资料进行恰当的选择和组织，这对中学生物学教学具有重要意义。

1 生物科学史的选择要基于科学事实

科学事实是通过观察和实验所获得的经验事实，是经过科学整理和鉴定的确定事件。一个科学事实往往是先通过观察，然后通过推断，接着经过一系列的验证和应用才被人所承认。科学事实具有重复性、精确性、可靠性等特征。科学事实是科学认识形成的基础，学生要形成对生物学的正确认识，就要掌握正确的科学事实。

《新课标》颁布后，高中生物学教材也进行了一轮革新，教材内容进行了一些调整，增添了生物科技进展、生物科学史话、科技探索之路、科学家的故事等栏目，介绍了生物学的最新进展以及生物科学的发展历程。

《新课标》对生物技术与工程模块提出几个大概念，其中包括“基因工程赋予生物新的遗传特性”，并提出开展以下教学活动：①DNA的提取和鉴定；②利用聚合酶链式反应（PCR）扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验。

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）是根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分和反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。目前，我国不同版本高中生物学教材对PCR发明时间表述不一（表1）。下面通过比较中美现有的几种高中生物学教材，结合国内外对PCR反应的相关文献资料、采访、自传等，探索PCR发明历程，确定其发明时间。

表1 不同生物学教材中对PCR发明时间的描述

目前，生物学教材中对PCR发明时间的描述主要是1983年和1985年。那么，PCR技术到底是哪一年发明的呢？

2 PCR科学史

为准确把握PCR发明的时间历程，依据穆里斯发表的《聚合酶链反应的不寻常起源》《心灵裸舞》和保罗·拉比诺发表的《PCR传奇：一个生物技术的故事》等有关资料，对PCR的发明历程进行梳理。

2.1 PCR的发明过程

穆里斯的自传《心灵裸舞》中描述到，1983年4月的一个周五晚上，穆里斯在128公路开车的过程中构思出PCR的概念。接着，穆里斯在Cetus图书馆进行相关文献检索，又询问公司内外的科学家和技术人员，但没人听说过这种技术。1983年8月，穆里斯首次在Cetus公司会议上提出PCR的概念。那时，仅有几个人感兴趣。

1983年9月到12月，穆里斯开始一系列的实验。1983年9月8日，穆里斯进行第一次PCR实验，以人类生长因子基因作为扩增目标，分离出一段长约400 bp的片段，采用11 bp和13 bp长的寡核苷酸引物以及聚合酶商用缓冲液，将它们放在一个试管里进行加热、冷却、再加热，第一次实验并没有成功。在10月份进行的第二次PCR实验中，穆里斯利用相同的试剂和程序，进行加热溶液、冷却和添加酶的5或10个循环，第二次实验还是没有成功。

接下来，穆里斯继续深入地探索。穆里斯和助手法鲁纳选择一个较小的目标，采用细菌质粒并尝试更小反应体积和更集中的反应。实验结果表明在凝胶中确实有东西被扩增，但不能明确说明扩增了多少。穆里斯认为他和法鲁纳建立了成功的PCR反应。

虽然穆里斯已经积累一定的实验数据，但仍没有明确的证据证明PCR实验取得成功。

直到1984年10月底，日裔研究员才木全职从事PCR工作。1984年11月15日，才木等人的实验证明有适当大小的产物被扩增，但结果仍然不能令人信服。他们需要更明确的数据来证明特异性。

1984年冬～1985年春，才木等人进行扩增β-珠蛋白的实验，团队成员用可靠和可量化的数据证明，他们可以将目的基因组DNA扩增数十万倍，实验结果通过放射性定量特定序列的数量和使用寡聚体限制分析来确定。

1985年，Cetus公司计划在10月下旬召开的美国人类遗传学会议上介绍PCR在人类遗传病中的应用。Cetus公司要求穆里斯根据pBR322质粒的实验数据撰写一篇关于PCR理论概念的文章；另一篇关于β-珠蛋白PCR扩增的应用性文章在理论性论文后提交。但穆里斯坚决反对公司计划，他主张将PCR作为一个商业秘密，不发表任何文章。

1985年9月20日，才木等人如期提交了PCR应用性的文章《酶促扩增β-珠蛋白基因组序列和限制性位点分析用于诊断镰状细胞性贫血》（Enzymatic amplifi⁃cation of β-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia），1985年12月发表在上。

1985年12月，穆里斯向杂志提交PCR理论性文章《通过聚合酶催化的链式反应在体外特异性合成 DNA》（Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction），但这篇论文被拒了；穆里斯重新向提交这篇文章，文章也被拒。公司建议穆里斯将两次被拒绝的文章提交给。当这篇文章1987年发表在时，PCR的信息已广为人知。

将PCR引入机器的最后环节是需要一种更有效、更特异的聚合酶。穆里斯在1986年第一个提出使用耐热的聚合酶，Cetus公司在1988年将提纯的热稳定DNA聚合酶运用到实验中，实验效果比之前更好。于是，1988年才木等人在上发表了《引物导向的酶促扩增DNA与热稳定DNA聚合酶》（Primer-direct⁃ed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase）的文章，使得PCR技术获得真正的实践意义。

直到1987年6月，PCR专利才出现。

2.2 PCR技术相关文献及其说明（1985—1988年）

1985年，才木等人在上发表了的论文是第一篇正式发表的PCR文章，采用新方法建立镰状细胞性贫血的快速、高灵敏度产前诊断实验，反复的变性、引物退火和延伸循环导致引物连接的110碱基对区域成指数积累。种新方法就是聚合酶链式反应。

1986年，穆里斯在冷泉港定量生物学研讨会上进行《DNA体外特异性酶促扩增：聚合酶链式反应》（Spe⁃cific enzymatic amplification of DNA in vitro：the poly⁃merase chain reaction）的报告。

1986年，沙尔夫等人在上发表了《酶促扩增基因组序列的直接克隆和序列分析》（Direct clon⁃ing and sequence analysis of enzymatically amplified ge⁃nomic sequences）。

1986年，才木等人在上发表了《用等位基因特异性寡核苷酸探针分析酶促扩增的β珠蛋白和HLA-DQα DNA》（Analysis of enzymatically amplified β-globin and HLA-DQα DNA with allele-specific oli⁃gonucleotide probes）。

1987年，穆里斯和法鲁纳的《通过聚合酶催化的链式反应在体外特异性合成DNA》在上发表。这篇文章是1985年穆里斯投给和被拒的文章，也是Cetus公司要求发表的两篇文章之一。

1987年，才木等人在上发表了《使用扩增单拷贝DNA的直接基因组测序表征β-地中海贫血突变》（Characterization of β-thalassaemiamutations using direct genomic sequencing of amplified single copy DNA）。在PCR中使用耐热DNA聚合酶（Saiki等人准备中的手稿），将PCR和扩增产物的序列分析相结合应用于人类单拷贝基因。

1988年，才木等人在上正式发表了《引物导向的酶促扩增DNA与热稳定DNA聚合酶》，从栖热菌中分离出来的DNA聚合酶极大地简化PCR程序，并且扩增反应能够在更高的温度下进行，显著提高扩增产物的特异性、产量、灵敏度和长度。1989年，将DNA聚合酶誉为“年度分子”。

1988年，福克斯等人在上发表了《聚合酶链反应以低成本实现自动化》（Poly⁃merase chain reaction automated at low cost），Cetus公司推出了第一台PCR自动仪，PCR实现自动化。

PCR技术从1985年正式发表以来，经过两三年发展，在1988年应用得到井喷式增长。1985～1987年，发表文献仅10篇，都是Cetus公司研究员所发表的，到1988年发表的文章达上百篇。纽约时报评价PCR技术将生物学划分为PCR前时代和PCR后时代。

2.3 明确PCR技术发明时间

只有当一个实验系统被开发出来时，PCR技术才能成为一个科学实体。穆里斯在1983年提出了多聚酶链式反应的概念，在当时仅仅是一种概念，并没有成为一种技术。因此，1983年PCR技术并未真正诞生，当时只是提出了多聚酶链式反应的概念。值得一提的是，1971年发表的一篇文章中提到了双引物系统和“修补复制”的概念，这是PCR的雏形，不过基于此的经验思路没有实现。

1985年，才木等人的《酶促扩增β-珠蛋白基因组序列和限制性位点分析用于诊断镰状细胞性贫血》文章在上发表，代表着PCR技术的诞生。科学事实的一个重要特征就是可重复性，1985年之前的实验无法满足重复性这一特征，也无法证实扩增条带的特异性，1985年的β-珠蛋白基因组序列的酶切扩增实验能够证实扩增序列具有特异性，也具有重复性。穆里斯关于PCR的构想终于在才木和法鲁纳等人的帮助下取得成功。

因此认为1985年穆里斯等人发明了PCR技术。

3 PCR技术发展与应用

3.1 实时荧光定量PCR

最初的PCR技术通过凝胶电泳对产物进行检测，只能定性分析，不能定量分析。1992年，Higuchi开发了实时荧光PCR技术，开启了PCR由定性到定量的应用。在Higuchi等人DNA扩增反应的实时监测实验中，利用溴化乙锭（EtBr）结合到双链DNA中，通过增强荧光信号来检测每个PCR中DNA的积累，热循环过程中荧光积累的动力学与DNA拷贝的起始数量相关。这种方法分析特异性DNA序列，可在一定范围内定量检测，一旦开始扩增就不需要打开试管取样，减少了所需的人工量，简化了过程，降低了PCR产品污染的风险。

实时荧光定量PCR是目前市场上最主流的PCR技术，成熟应用于各种分子生物学研究和医学研究之中，但依赖Cycle threshold值（简称CT，即每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所需要的循环数）的相对定量方式、灵敏度低等特征限制了其在很多临床领域的应用。

3.2 PCR的应用

PCR技术目前在医学诊断、食品检测、农业科学等许多方面均有广泛应用，是世界上所有分子生物学实验室最常规、基础的实验技术之一。在病原体的检测中，许多病原体已经有相应的PCR检测试剂盒。这些试剂盒能高效率、敏感地找出潜伏病毒的存在。

在新冠疫情下，新冠核酸检测已成为世界人民生活的一部分。目前的新冠病毒核酸检测大多采用荧光定量PCR技术。将新型冠状病毒核酸RNA逆转录为cDNA，以新冠病毒的cDNA为靶基因，通过PCR扩增，使这段靶DNA序列呈指数级增加，每一个扩增出来的DNA序列都可与预先加入的一段荧光标记探针结合，产生荧光信号。扩增出来的靶基因越多，累计的荧光信号就越强。因此，核酸检测就是通过检测荧光信号的累积来确定样本中是否有病毒核酸。