基于网络药理学的铁皮石斛免疫调节作用机制

李振宇 ,赵建霞 ,张国亮,3 ,王晓彤 ,王瑛 ,徐靖 ,李明焱,李振皓,3∗

(1.浙江寿仙谷植物药研究院有限公司,浙江 杭州 310000;2.浙江寿仙谷医药股份有限公司,浙江 武义 321200;3.浙江省珍稀植物药工程技术研究中心,浙江 武义 321200;4.寿仙谷珍稀药材产品省级重点农业企业研究院,浙江 武义 321200)

机体的免疫调节系统能识别并排除异己抗原性物质以及体内发生突变的肿瘤细胞、衰老细胞、死亡细胞等,从而维持机体生理动态平衡与稳定性。人体免疫系统的紊乱会诱发多种疾病,目前临床上主要应用胸腺肽、球蛋白等免疫增强剂来提高患者免疫功能,但会伴有不同程度的副作用,如过敏、肝肾损伤、继发性重症感染等[1]。相比之下,中药对免疫功能具有双向调节作用,可增强机体免疫器官、免疫细胞、免疫分子的作用,也可协助机体对抗炎症、自身免疫性疾病、超敏反应、排斥反应。免疫调节的双向性与中药剂量、机体的机能状态、中药的不同成分等有关[2]。

铁皮石斛 (Dendrobiumofficinale) 为药用兰科植物的茎,在中国及许多亚洲国家被作为一种传统草药广泛应用,具有益胃生津、滋阴清热的功效,可用于热病津伤、口干烦渴、胃阴不足等。现代研究[3]表明,铁皮石斛含有多糖、黄酮、酚酸、芪类等多种化学成分,在增强免疫、降血糖、抗肿瘤等方面具有良好作用。铁皮石斛多糖的2 个亚组分DOPa 及DOPb,可增强小鼠RAW264.7 细胞的增殖及吞噬作用,诱导TNF-α 的分泌和淋巴细胞的增殖,且具有剂量依赖性[4]。口服铁皮石斛细粉及石斛粗多糖均可以显著增强小鼠的细胞免疫和非特异性免疫,明显促进了小鼠脾细胞IFN-γ 的分泌,口服铁皮石斛后,体液免疫力也得到增强[5]。铁皮石斛超微粉末和铁皮石斛水提物可使细胞免疫功能、体液免疫功能、单核巨噬细胞吞噬功能和NK 细胞活性明显增强[6]。

目前,多糖被认为是铁皮石斛调节免疫的主要活性成分之一。但是,铁皮石斛中含有的黄酮、酚酸类成分也可能具有免疫调节活性[7],但活性成分尚未系统阐明,相关的药效学及作用机制研究也较少。本文应用网络药理学,探究铁皮石斛具有免疫活性的小分子成分及其潜在的作用靶点及通路,从系统性和整体性出发,揭示铁皮石斛中参与免疫调节的物质基础与作用机制,为铁皮石斛的深入开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 化合物筛选及靶点预测

从文献以及数据库中收集铁皮石斛的小分子化合 物,再通过 SwissADME (http://www.swissadme.ch/) 进一步筛选潜在活性较高的优效化合物。筛选标准为:药代动力学中胃肠吸收(GI bsorption) 高,类药性 (Druglikeness) 指标中Lipinski、Ghose 等指标存在2 个或以上 “YES”。

通过 Swiss Target Prediction (http://www.swisstargetprediction.ch/) 预测化合物相应靶点,选择物种为 “Homo sapiens”,筛选possibility 大于0.1 的靶点。

1.2 免疫调节相关靶点的检索

在Genecards 数据库(https://www.genecards.org/)中以 “immunoregulation” 为关键词,搜集免疫调节相关的靶点,将免疫调节相关的靶点集与铁皮石斛候选靶点集取交集,作为铁皮石斛免疫调节相关靶点。通过Cytoscape 建立化合物-铁皮石斛免疫调节相关靶点的网络图。

1.3 免疫调节靶点蛋白互作网络构建

将铁皮石斛免疫调节相关靶点导入STRING(https://string-db.org/) 网站,限定物种选择“Homo sapiens”,将Combined score 大于0.9 的网络数据导入Cytoscape 软件构建PPI 网络,通过Cytoscape 软件中工具栏中 “Analysis Network” 功能对整个PPI 网络的拓扑参数进行计算,以 “度(degree) ” 的2 倍中位数、紧密度 (Closeness)和介数 (Betweenness) 的中位数为卡值,筛选核心靶点,并在PPI 网络图查看核心靶点与其他靶点的相互作用关系。

1.4 核心靶点生物学功能富集分析

通过R 语言Cluster Profiler 包对核心靶点进行GO 分析和KEGG 分析,从生物过程、分子水平、细胞水平3 个方面分别进行GO 富集分析,并进一步对其进行KEGG 通路富集分析。以P<0.05 为标准进行筛选,并将结果以条形图和气泡图的形式输出。

为了说明铁皮石斛核心靶点与化合物、通路间的相互作用关系,通过 Cytoscape 软件中的“merge” 功能,将化合物-铁皮石斛免疫调节相关靶点网络、核心靶点-生物功能网络进行整合,建立化合物-核心靶点-生物功能网络图。

2 结果与分析

2.1 优效化合物筛选及免疫靶点预测

本研究从文献中共筛选铁皮石斛优效化合物124 个,包括7 个菲类化合物、26 个联苄类化合物、15 个酚类化合物、50 个酸类化合物、5 个酰胺类化合物、12 个黄酮类化合物、9 个其他化合物,共预测到相关靶点421 个。

通过Genecards 数据库获得免疫调节相关靶点569 个,通过与铁皮石斛的421 个候选靶点取交集,获得58 个共有靶点,对应60 个化合物,构建化合物-铁皮石斛免疫调节相关靶点网络图 (图1)。外层红色节点为60 个化合物,内部绿色节点为58 个免疫调节靶点,共321 条边,节点的大小与度值成正比,且节点按度值大小顺时针排列,每个化合物平均与5.35 个靶点相互作用,每个靶点平均与5.53 个化合物相互作用。度值最大的10 个化合物包括 2-O-甲基槲皮素 (Di-Omethylquercetin)、槲皮素 (Quercetin)、金圣草黄素 (5-7-Dihydroxy-2-4-hydroxy-3-methoxyphenyl-4H-1-benzopyran-4-one)、异鼠李 素 (Isorhamnetin)、芹菜素 (Apigenin)、二氢槲皮素 (Taxifolin)、二氢阿魏酸酪胺 (Dihydro feruloyltyramine)、柚皮素(Naringenin)、铁皮石斛素M (Dendrocandin M)、丁香树脂酚 ((-) Syringaresinol),其中包括8 个黄酮、1 个联苄、1 个木脂素。

图1 化合物-铁皮石斛免疫调节靶点网络

2.2 免疫调节相关靶点蛋白互作网络构建

将58 个共有靶点导入STRING 11.0 数据库,筛选靶点间相互作用得分大于0.9 的靶点绘制PPI网络图 (图2)。共41 个靶点存在明显的相互作用关系,节点大小与颜色深度均与度值成正比,节点间连线的粗细与相关强度成正比。其中节点最大的9 个靶点为核心靶点,包括TNF、SRC、VEGFA、AKT1、MMP9、STAT1、NOS2、MAPK14、EGFR,提示铁皮石斛可以通过这9 个核心靶点发挥免疫调节作用。

图2 铁皮石斛免疫调节相关靶点PPI 网络

2.3 核心靶点生物学功能富集分析

基于R 语言对核心靶点进行GO 分析和KEGG分析,GO 分析获得2 059 个条目,KEGG 分析获得153 个代谢通路,筛选了较显著的GO 注释结果和KEGG 通路进行作图。细胞组分注释结果如图3中A,主要涉及膜筏 (membrane raft)、膜微结构域 (membrane microdomain)、膜区 (membrane region)、嚢腔 (vesiclelumen)、多泡体(multivesicular body) 等细胞组分;生物过程注释结果如图3 中B,主要涉及对活性氧类的响应(response to reactive oxygen species)、肽基丝氨酸磷酸化 (peptidyl-serine phosphorylation)、肌肉细胞增殖 (muscle cell proliferation)、肽基丝 氨酸修饰(peptidyl-serine modification)、平滑肌细胞增殖的正向调控 (positive regulation of smooth muscle cell proliferation) 等;分子水平注释结果如图3 中C,主要涉及蛋白磷酸酶结合 (protein phosphatase binding)、磷酸酶结合 (phosphatase binding)、一氧化氮合酶调节活性 (nitric-oxide synthase regulator activity)、钙调素结合 (calmodulin binding)、蛋白磷酸酶2A 结合 (protein phosphatase 2A binding)等。KEGG 通路富集结果如图3 中D,主要涉及松弛素信号通路 (relaxin signaling pathway)、癌症中的蛋白多糖 (proteoglycans in cancer)、流体剪切应力与动脉粥样硬化 (fluid shear stress and atherosclerosis)、乙型肝炎 (hepatitis B)、肺结核(tuberculosis) 等。

图3 核心靶点GO、KEGG 富集分析结果

建立化合物-核心靶点-生物功能网络图 (图4),中间竖排黄色节点为核心靶点,左侧圈状排列红色节点为铁皮石斛化合物,右侧圈状排列绿色节点为核心靶点富集到的生物功能,节点大小与度值成正比,且化合物、生物功能节点按度值大小顺时针排列,靶点节点按度值大小自上而下排列。其中EGFR 度值最高,其与11 个化合物及40 个生物功能相连接,揭示铁皮石斛中2-O-甲基槲皮素、异鼠李素、槲皮素、5-7-羟基-2-4-羟基-3-金圣草黄素、芹菜素、秦皮乙素、N-反式阿魏酰酪胺、对羟基苯丙酸、p-羟基苯丙酸、二氢阿魏酸酪胺、阿魏酸酰胺等11 个化合物可通过EGFR 等靶点及40个生物功能发挥免疫调节作用。

图4 化合物-核心靶点-生物功能网络

3 讨论

免疫系统是维持机体生理动态平衡与稳定性的重要条件,病毒感 染、炎 症[8]、糖尿病[9]、癌症[10]等疾病的治疗效果与愈后与机体免疫密切相关。此次新冠疫情中也发现,感染新冠病毒后是否转为重症与机体免疫状态相关[11]。本研究以铁皮石斛中菲类、联苄类、酚类、酸类、酰胺类、黄酮类等小分子化合物为研究对象,运用网络药理学方法探究铁皮石斛中免疫活性成分及其作用机制。研究结果显示,铁皮石斛中黄酮类小分子化合物为主要的潜在免疫活性成分,主要通过TNF、SRC、VEGFA、AKT1、MMP9、STAT1、NOS2、MAPK14、EGFR 等靶点发挥免疫调节作用。

通过文献对筛选的免疫活性成分的作用机制及靶点进行初步验证。在10 个潜在的免疫活性化合物中,8 个为黄酮类化合物。其中,槲皮素有22个潜在免疫靶点,研究表明,槲皮素可以通过增强中性粒细胞趋化性、巨噬细胞吞噬作用、NK 细胞裂解活性、淋巴细胞增殖速率等发挥免疫调节作用[12]。异鼠李素、柚皮素分别有20 和11 个潜在免疫相关靶点,是较为常见的黄酮类化合物,在款冬花、藿香等中药以及清肺排毒汤中也有相关报道[13]。研究[14]发现,异鼠李素、槲皮素、柚皮素等可以通过抑制细胞因子的释放,缓解过度的免疫反应、消除炎症,可能也是清肺排毒汤重要的药效成分。芹菜素有19 个潜在免疫调节靶点,其通过增多氧和氮自由基、抗体生成来增强免疫反应[15]。Zhang 等[16]研究发现,芹菜素通过调节巨噬细胞中的多个信号通路,显著抑制脂多糖 (LPS) 诱导的促炎性细胞因子 (如IL-6、IL-1β 和TNF-α) 的产生。Coelho 等[17]研究发现,芹菜素可恢复小神经胶质细胞对神经胶质瘤细胞的免疫特性。Taxifolin 有15 个潜在免疫调节相关靶点,Jung等[18]研究发现,槲皮素、二氢槲皮素化合物在10～500 μmol·L-1浓度范围内,强烈抑制胸腺嘧啶与DNA 的结合,在低浓度下,对胸腺嘧啶与DNA 的结合具有轻微增强作用,说明槲皮素、二氢槲皮素化合物对免疫细胞的影响具有双向调节作用。上述文献与本文结果一致,说明网络药理学方法具有良好的准确性,但实验结果需通过进一步实验进行筛选和验证。

本研究也发现,铁皮石斛可作用于 TNF、SRC、VEGFA、AKT1、MMP9、STAT1、NOS2、MAPK14、EGFR 等核心靶点。TNF 作为一种炎性细胞因子,在急性炎症过程中由巨噬细胞或单核细胞、T 细胞等分泌,可以诱导细胞凋亡,具有抗感染和抗癌作用[19],同时也具有引发炎症反应的不良作用[20]。SRC 家族激酶构成了先天细胞中表达最大的胞质酪氨酸激酶家族,这些激酶被认为是许多免疫细胞受体下游的主要信号分子,包括免疫受体、细胞因子受体、整合素和各种病原体受体[21]。血管内皮生长因子 (VEGFA) 家族通过直接抑制抗原呈递细胞以及免疫效应细胞或增强调节性T细胞、髓源性抑制细胞 (MDSC) 的作用来驱动免疫抑制;免疫抑制性细胞也可以驱动血管生成,从而导致免疫激活受损的恶性循环[22]。AKT1 是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 (AKT) 之一,AKT 信号通路成分调节巨噬细胞的存活、迁移和增殖,也可以协调巨噬细胞对不同代谢和炎症信号的反应[23]。MMP9 参与了免疫/炎症反应,具有加工和激活各种细胞因子和趋化因子的能力,如果释放不当,MMP9 会导致多种脑部疾病,如癫痫、精神分裂症、自闭症谱系障碍、脑损伤、中风、神经退行性疾病、疼痛、脑瘤等[24]。信号转导器和转录激活器 (STAT1),介导细胞对干扰素 (IFNs)、细胞因子和生长因子的反应,使细胞处于抗病毒状态[25-26]。NOS2 是一种在全身具有多种功能的信使分子,能产生一氧化氮 (NO),NO 水平的变化会影响组织氧化还原环境和免疫力[27]。星形胶质细胞中的丝氨酸/苏氨酸激酶 (MAPK14) 主要调节细胞因子(TNFα、IL-6) 和趋化因子(CCL2、CCL4、CXCL1、CXCL2、CXCL10) 的特定亚群,从而影响星形胶质细胞免疫激活[28]。表皮生长因子 (EGFR) 突变导致非小细胞肺癌NSCLC 微环境中免疫浸润的减少或免疫细胞的浸润不足[29]。

在2 059 个GO 条目及153 个KEGG 代谢通路中,以P值靠前的生物功能为依据,发现免疫调节过程涉及的主要细胞组分为细胞质膜,涉及的主要分子水平有磷酸酶结合、一氧化氮合酶调节活性、钙调素结合,涉及的生物过程主要有活性氧类的回应、肌肉细胞增殖、肽基丝氨酸修饰调控等。KEGG 信号通路主要涉及松弛素信号通路、癌症中的蛋白多糖、流体剪切应力与动脉粥样硬化、乙型肝炎、肺结核等。综上所述,铁皮石斛中的2-O-甲基槲皮素、槲皮素、金圣草黄素、异鼠李素等主要活性成分可能通过免疫因子、免疫细胞等相关信号通路 作用于 TNF、SRC、VEGFA、AKT1、MMP9、STAT1、NOS2、MAPK14、EGFR 等关键靶点,发挥双向免疫调节作用。上述结果应进一步从分子、细胞及整体动物层面进行验证。