酶促水解制备猪脑抗氧化活性肽

卢文静 ,陈佳佳 ,谌迪 ,叶沁 ,肖朝耿∗ ,黄光荣 ,张治国,周天琼

(1.浙江省农业科学院 食品科学研究所,浙江 杭州 310021;2.中国计量大学 生命科学学院,浙江 杭州 310018;3.杭州华津药业股份有限公司,浙江 杭州 311241)

猪脑不仅鲜嫩可口、营养丰富,还可以増加机体的免疫力,是传统的健脑食品。猪脑含有丰富的蛋白质,约占新鲜猪脑的10%[1-2]。研究者从动物脑组织中分离蛋白质,采用酶法水解成游离的氨基酸和低分子水解物,用来治疗脑相关的疾病[3]。猪脑多肽水解产物具有促进脑代谢等功效,能够提高脑组织无氧代谢的ATP 生成量,减少氧自由基生成及类似神经生长因子刺激激素生成等[4]。早在20 世纪,我国就已开发出镇脑宁等以猪脑为原料的中药制剂用于治疗头痛。此外,由猪脑制备的脑活素已在临床上广泛应用40 a,它是75%游离氨基酸和25%短链肽的混合物,短肽可能是其生理活性成分[5]。张文治等[6]研究发现,采用乳猪制备的脑活性多肽与价格昂贵的进口脑活素发挥类似作用。猪脑水解物可显著增强小鼠的学习记忆能力[7],其中水解物的活性短肽可作为类似内源神经营养因子缓解脊髓型颈椎病[8]。此外,猪脑多肽保护神经元防止大脑损伤,而很多神经性疾病的产生与活性氧等自由基相关[9]。

近年来,抗氧化肽逐渐成为研究热点。特别是通过生物酶解法制备抗氧化肽,具有专一性强、反应条件温和、反应过程容易控制、对环境友好和无毒性物质产生等优点。目前生物酶解法制备抗氧化肽已广泛应用于动植物源抗氧化肽的制备[10-13]。通过酶解制备的生物活性肽不仅具有抗氧化活性,其抗菌、免疫调节等功能也有文献报道[14-16]。猪脑酶解多肽目前主要被用于治疗脑功能障碍疾病,如奥地利生产的脑活素 (Cerebrolyzin)、日本生产的Ceremon 及德国、罗马尼亚生产的Crelizin 都是通过酶水解脑蛋白水解物获得的制剂[5]。猪脑酶解物能抑制脂质过氧化、降低脂质过氧化物丙二醛的含量,改善β-淀粉样诱导的小鼠空间记忆力损伤[17]。吴科锋等[18]采用碱化酶法制备猪脑多肽,发现多肽分子量主要集中在250～2 000 u,且能减轻H2O2诱导的PC12 细胞毒性作用,降低活性氧生成,对氧化损伤具有保护作用。虽然已有文献报道了酶解猪脑多肽抗氧化的活性,但基于抗氧化活性优化猪脑多肽制备的研究很少。因此,本文采用食品工业常用的生物酶,以酶解率为指标,筛选出猪脑生物酶解适用酶,随后采用超滤截留不同分子量的多肽,考查酶解液不同组分多肽的总抗氧化活性,以总抗氧化活性为指标通过正交法优化酶解工艺,以期为猪脑抗氧化肽的制备提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与试剂

新鲜猪脑 (购自农贸市场);Novozym 37071、Pectinex UF、Celluclast 1.5 L (700 U·g-1)、Flavourzyme 500 MG (500 LAPU·g-1)、Neutrase 0.8 L (0.8 AU·g-1)、Alcalase 2.5 L (2.5 AU·g-1)、Alcalase 2.4 L (2.4 AU·g-1)、Alcalase 3.0 T (3.0 AU·g-1)、Palatase 2 000 L (脂肪酶,20 000 U·g-1) 和Ban 480 L (淀粉酶,480KNU-B·g-1),诺维信 (中国) 生物技术有限公司;木瓜蛋白酶 (100 000 U·g-1),南宁庞博生物工程有限公司;胰蛋白酶 (1∶250) 和胃蛋白酶 (1∶30 000),上海源叶生物科技有限公司;标准牛血清蛋白,生工生物工程 (上海) 股份有限公司;总抗氧化能力试剂盒,碧云天生物技术有限公司。其他试剂均为国产分析纯。

1.1.2 主要仪器与设备

5424R 冷冻离心机,德国Eppendorf 公司;Spectra MAX190 全波长酶标仪,美国MD 公司;超滤设备,美国Millipore 公司;pH 计,上海三星仪器有限公司;ULTRA-TURRAX T1.8basic 匀浆机,德国IKA 公司;电热恒温水浴锅,上海精宏实验设备有限公司;粉碎机,德清拜杰电器有限公司;烘箱,上海一恒科学仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 猪脑多肽水解酶的筛选

新鲜猪脑自然解冻后,除去血块和脑膜 (软脑膜和蛛网膜),用生理盐水冲洗干净,均质机匀浆得到猪脑匀浆,密封于冰箱中冷藏储存备用[19]。准确称取猪脑匀浆1.00 g,置于250 mL 锥形瓶中,加入200 mL 去离子水,磁力搅拌30 min,根据表1 进行酶解,酶解率计算公式为:酶的水解率=(酶解后水溶性蛋白含量-酶解前水溶性蛋白含量) ×酶解液体积÷猪脑的质量×100%。

表1 13 种酶的酶解环境

1.2.2 猪脑多肽含量测定

猪脑多肽含量测定采用Bradford 法测定并作适当修改[20]:取标准品牛血清蛋白制备浓度分别为0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg·mL-1梯度浓度牛血清蛋白溶液,取50 μL 上述标准液于96 孔板中,加入200 μL 考马斯亮蓝G250,混匀,室温静置10 min,检测595 nm 处吸光值。以吸光值为纵坐标,牛血清蛋白质浓度为横坐标,绘制标准曲线。待测品的制备:取合适浓度的样品50 μL于96 孔板中,加入200 μL 考马斯亮蓝试剂,混匀,静置10 min,检测595 nm 处吸光值,根据回归方程计算蛋白质含量。

1.2.3 酶解多肽分子量的超滤分离

将酶解液于Millipore 超滤装置中利用截留量分子依次为5 和1 ku 截留模块超滤10 min,制备得到3 种分子量范围多肽,即>5 ku、1～ 5 ku 和<1 ku 的多肽。

1.2.4 酶解多肽抗氧化活性测定方法

不同酶解液的总抗氧化能力测定参考碧云天ABTS 总抗氧化能力试剂盒说明书。将检测缓冲液、ABTS 溶液和1/1 000 过氧化氢溶液按152∶10∶8 的比例配制新鲜ABTS 工作液;把10 mmol Trolox 标准溶液 稀释成 0.15、0.3、0.6、0.9、1.2 和1.5 mmol。在96 孔板每个检测孔加入20 μL 过氧化物酶的工作液,空白对照孔中加入10 μL 蒸馏水;标准曲线检测孔内加入10 μL 各种浓度的Trolox 标准溶液;样品检测孔内加入10 μL 各种待测样品,混匀后每个孔内加入170 μL ABTS 工作液,轻轻混匀后室温孵育6 min 后酶标仪于414 nm处进行测定。根据标准曲线计算出样品的总抗氧化能力。总抗氧化能力计算公式为:总抗氧化能力(mmol·g-1)=Trolox 当量浓度 (mmol) ÷样品蛋白浓度 (mg·mL-1) ×稀释倍数。

1.2.5 猪脑抗氧化活性肽提取工艺优化

通过单因素试验发现,猪脑抗氧化活性肽的酶解工艺受到加酶量、pH、酶解温度和酶解时间的影响较大。为了优化抗氧化活性肽酶解工艺,采用L9 (34) 正交试验优化猪脑抗氧化活性肽提取工艺中胰蛋白酶加入量、pH、酶解温度以及酶解时间。各因素1、2、3 水平分别为:胰蛋白酶加入量20、25、30 mg;pH 7.0、7.5、8.0;酶解温度40、45、50 ℃;酶解时间 3、4、5 h。

1.2.6 数据统计

试验结果通过SPSS 18.0 软件分析,组间差异比较采用One-way ANOVA 检验来比较其差异显著性。

2 结果与分析

2.1 13 种酶水解率大小关系

由图1 可得,对于上述13 种酶,可以发现胃蛋白酶的水解率显著高于其他12 种酶,其次为Ban 480 L;Palatase 2 000 L 的水解率稍高于胰蛋白酶,但二者之间没有显著性差异;木瓜蛋白酶、Alcalase 3.0 T、Alcalase 2.4 L 和Neutrase 0.8 L 的水解率之间也没有显著性差异,水解率次于胃蛋白酶、Ban 480 L、胰蛋白酶和 Palatase 2 000 L;Novozym 37071、Pectinex UF、Celluclast 1.5 L、Flavourzyme 500 MG 和Alcalase 2.5 L 之间的水解率无显著性差异,水解率均低于其他酶。对生产常用的13 种酶进行筛选,结果发现,猪脑采用一步法酶解制备抗氧化肽的过程中,水解率较高的有胃蛋白酶、Ban 480 L、Palatase 2 000 L 和胰蛋白酶。

图1 13 种酶酶解猪脑蛋白的水解率

2.2 不同分子量酶解物的总抗氧化能力

对胃蛋白酶、Ban 480 L、Palatase 2 000 L 和胰蛋白酶4 种酶的酶解液进行超滤处理,观察4 种酶各个组分的抗氧化情况。根据ABTS 法试剂盒说明书,总抗氧化能力标准曲线结果见表2。

表2 标准Trolox 溶液吸光值

总抗氧化能力标准曲线制备:以Trolox 浓度为横坐标,吸光值为纵坐标,求得回归方程,其中y=-0.678 7x+1.050 8,R2=0.998 5。

4 种酶解液通过截留分子量为5 和1 ku 截留模块超滤后,没有发现分子量>5 ku 的组分,说明4种酶解液水溶性成分的分子量主要分布在5 ku 以下。图2 可得,除Ban 480 L 外,其他3 种酶中分子量<1 ku 组分的总抗氧化能力显著高于1～5 ku组分;胰蛋白酶分子量<1 ku 组分的总抗氧化能力显著高于另外3 种酶。虽然Palatase 2 000 L 的总抗氧化能力稍高于胃蛋白酶,但二者之间无显著差异。而对Ban 480 L 来说,不论其分子量<1 ku 组分还是1～5 ku 组分,其总抗氧化能力均为最低。本研究结果发现,抗氧化活性肽主要集中在分子量<1 ku 的部分,这与Zhang 等[5]发现低分子量的短链猪脑多肽具有显著的生物活性报导相似。

图2 4 种酶超滤物的总抗氧化能力

2.3 正交试验结果

根据因素与水平,以总抗氧化能力为指标优化提取工艺。本试验研究了对猪脑抗氧化活性肽酶解工艺影响较大的4 个因素,即胰蛋白酶的加酶量、pH、酶解温度、酶解时间。影响酶解工艺的主次因素依次是酶解时间、pH、酶解温度、加酶量。较优水平是酶解时间3 h,pH 为7.0,酶解温度为40 ℃,加酶量为20 mg,在最适条件下,总抗氧化能力为17.03 mmol·g-1。

3 小结与讨论

本试验以酶的水解率为指标,对猪脑蛋白水解工艺所用酶种类进行筛选,发现胃蛋白酶、Ban 480 L、Palatase 2 000 L 和胰蛋白酶4 种酶的酶解率相对较高。针对上述4 种酶的酶解液进行超滤处理,发现酶解液以分子量<1 ku 和1～5 ku 组分为主,且猪脑抗氧化活性肽很可能集中于分子量<1 ku 组分。为了提高猪脑抗氧化活性肽的总抗氧化能力,基于加酶量、酶解时间、酶解温度、pH设计正交试验,最终得到的较优水平为酶解时间3 h,pH 为7.0,酶解温度为40 ℃,加酶量为20 mg,此时的总抗氧化能力为17.03 mmol·g-1。本试验可为猪脑多肽的生物活性研究及高值化利用提供参考。