超级增强子在前列腺癌中的研究进展

龙军， 陈林， 杨亚飞， 何江枢， 李嘉， 汪松， 陈书练， 梁国标， 杨进

泌尿系统肿瘤中前列腺癌是最常见的恶性肿瘤。最新世界肿瘤数据库(GLOBOCAN)数据显示,前列腺癌已成为世界第二大常见癌症,为男性癌症死亡的第五大因素[1]。目前治疗方法包括手术、放疗、化疗等，但这些方法效果有限，仍不能很好改善患者的预后及生存情况。靶向治疗能带来不错的治疗效果，因此，探索新的分子靶点，势在必行。

增强子是一类非编码DNA调控序列，结合了RNA聚合酶Ⅱ、转录因子(transcription factors,TFs)、辅助激活因子、调节因子(MED1、OGT等)等，增加启动子活性并促进靶基因转录发挥正向调控作用[2]。增强子对基因的调控可以发生在同一基因的不同位置，或是不同染色质上的基因。甚至在某些情况下，单个增强子能对多个基因进行调控。超级增强子(super-enhancer, SE)是高密度结合了关键调控因子和中介子(Mediator)的增强子簇，含有细胞类型特异性转录因子，在控制细胞身份和调控细胞命运中发挥重要作用[3-4]。

在肿瘤发病机制中，癌细胞在致癌基因和其他基因上生成SE。后来的研究发现，正常细胞并不表达癌细胞所生成的SE调控的关键癌基因，这就表明SE可以通过调控这些关键基因维持肿瘤特性，在癌症的发生和发展中起到关键作用[5]。因此，SE的活化可以作为肿瘤预诊断的标志以及分子治疗的靶点，从而调控疾病特异性SE及其相关因子的活性，就有机会实现疾病的精准治疗。

1A：为增强子结构；1B：为超级增强子结构图1 增强子和超级增强子的结构

1 SE的结构特征与疾病中的调控功能

1.1 SE的结构特征 SE是一类增强子大簇，具有细胞特异性，控制细胞身份基因的表达。SE富集关键转录因子结合基序，可以大量结合关键TFs(Oct4、Sox2、Nanog、Klf4、Esrrb)，和增强子一样，促进靶基因的高水平转录，但SE作用效果较普通增强子高一个数量级(图1)。此外，SE的大小、所结合的TFs的量以及对干扰的敏感性都不同于普通增强子。SE还富含信号途径TFs DNA基序，从而结合相应信号途径终端TFs(如Wnt通路的TCF3、TGF-β通路中的SMAD3和LIF中的STATE3)，作为一个信号平台，汇集来自发育相关的信号通路传来的信号，这些信号协同调控SE活性启动相关基因转录[6]。SE除能激活蛋白编码基因的转录外，还能自身转录产生增强子RNA(eRNA)调控基因表达。通过测定增强子转录相关标记分子或组蛋白修饰改变，便可以鉴定SE，这些分子包括辅因子(Mediator和Cohensin)、组蛋白修饰标记(H3K27ac和H3K4me1)、染色质修饰分子(p300)等，其中H3K27ac能区分活性与非活性增强子，常作为鉴定的最佳选择[7-8]。也有报道发现增强子RNA(enhancer RNA,eRNA)较H3K27ac更适合用于鉴定增强子活性及新的增强子预测[9-10]。

1.2 SE在疾病中的调控作用 Dowen等[11]研究发现了SE结构域，能将SE的作用限制在结构域内而不影响邻近基因的表达，因此其结构完整性对邻近基因正常表达至关重要，若失去该限制功能，将可能导致邻近基因被SE异常激活而发生肿瘤。肿瘤细胞产生的SE也会结合许多肿瘤相关的信号通路TFs。在结直肠肿瘤中， Wnt信号通路相关的SE区域富集了大量TCF4，激活或者抑制该通路，便能调控SE相关的基因转录[6]。Raisner等[12]通过实验证实BAMBI基因(一种TGF-β通路抑制因子)为三阴乳腺癌所依赖，并在该基因近端和远端均发现有SE元件。这些SE元件与BAMBI基因之间相互关联，在敲除BAMBI基因后，HCC38细胞生长被显著抑制。

综上所述，SE由于其结构特殊性，可以通过多种方式调节疾病相关基因的表达，并影响疾病的预后，包括前列腺癌。进一步探究SE相关机制，将有助于寻找新的治疗靶点、研究新的靶向药物和优化疾病的诊治。

2 SE相关分子在前列腺癌中的作用

SE上结合了大量转录因子(如BRD4、CDKs、ERG、FOXA1等)、长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)、辅因子、染色质调节子、RNA聚合酶等[13-14]，作为一个信号平台发挥作用接收不同信号通路传来的信号，从而激活启动子调控下游关键基因的转录，包括肿瘤信号。(图2)2.1 BET/BRD4 BRD4是SE的重要组成部分，能识别并结合乙酰化组蛋白，协助Mediator募集到启动子区域，在转录启动后，促进正性转录延长因子(P-TEFb)募集到RNA pⅡ并通过P-TEFb激活聚合酶Ⅱ CTD的磷酸化，从而增加聚合酶Ⅱ依赖的转录[15]，是组织特异性SE的关键鉴别因素。

注：超级增强子结合多种转录因子，通过中介子与启动子相连，形成一定的结构域。接收不同信号通路的信息，进而影响靶基因的转录图2 SE在前列腺癌中的作用机制

在前列腺癌中，BRD4与雄激素受体(Androgen receptor,AR)的N端结合驱动AR介导的基因的表达[16]。AR阳性细胞系(VCaP等)对BET抑制剂(BET inhibitor,BETi)选择性敏感，而AR阴性细胞系(PC3等)不敏感[17-18]。在趋势抵抗性前列腺癌(castration- resistant prostate cancer，CRPC)，中BRD4也可以与ERG互作来控制常见基因的上调。此外，在前列腺癌中还有许多参与主要染色质相关程序和改变的蛋白也含有BRD4[19]。靶向BRD4和相关BET蛋白的溴结构域的抑制剂在临床前列腺癌模型中显示出疗效。

Wilflingseder等[20]研究发现，在肾损伤早期，下游信号转导被激活从而在增强子和SE上募集关键信号依赖转录因子(如STAT3或AP-1)进而使组蛋白发生乙酰化并与BRD4结合，促进肾修复关键基因的转录。在缺血再灌注损伤前，BRD4的功能缺失，将会导致急性肾损伤后出现恢复受损并且增加死亡率。因此，我们猜测在其他非肿瘤疾病中，或许SE也参与调控，但这还需要研究人员进一步探索。

2.2 CDKs CDKs控制关键细胞周期点和转录并对细胞内外增殖信号作出响应。CDKs相关的SE调控AR的募集以及RNA pII的磷酸化来促进靶基因的表达，也因此成为CDK抑制剂的治疗靶点。

TFIIH激酶CDK7通过磷酸化RNA pⅡ的C端域，从而发挥调控SE活性的作用[21]。此外，CDK7还能通过磷酸化AR来促进转录激活活性以及后续的蛋白降解[22-24]。在前列腺癌中，CDK7通过配体特异磷酸化激活MED1，被募集到AR结合的SE上导致SE相关的转录因子高密度装配[18]。在MED1的参与下，通过CDK7抑制能迅速阻断癌基因驱动因子AR等的表达[25-28]。在膀胱癌中，CDK7还能促进募集组蛋白甲基转移酶SETD1A/B和SETD2来影响染色质修饰[29-30]。

P-TEFb是转录过程中最主要的限速步骤和调控环节，它也位于SE上。P-TEFb复合物包含CDK9和cyclinT1，其活性形式cyclinT-CDK9-BRD4[31]。CDK9通过促进RNA pII的CTD中Ser2的磷酸化，启动转录延长。BRD4也可以在RNA pII的CTD促进CDK9调节的Ser2的磷酸化。CDK9能调节AR的稳定性，是下游AR靶基因的表达所需。CDK9通过N端磷酸化延长AR半衰期和活性，而未被磷酸化的AR将被降解。因此抑制CDK9可能为CRPC的治疗提供新的思路[15，32]。

CDK12主要通过磷酸化RNA pⅡ的C端域丝氨酸2(Ser2)来调节转录延长过程，已经证实CDK12为一些恶性肿瘤的致癌驱动因子(如胃癌、乳腺癌、前列腺癌)[33-36]。

2.3 ERG ERG是细胞特异性谱系分化和表达模式的必要转录因子，比如内皮细胞、造血细胞和官腔细胞分化[37-40]。其发挥作用主要是通过调控谱系特异性增强子和SE实现。ERG与染色质易位，产生不同融合基因，如前列腺癌中TMPRSS2-ERG、急性髓系白细胞中FUS-ERG和尤因肉瘤中EWS-ERG。TMPRSS2-ERG阳性的前列腺癌中，ERG过表达导致SE的形成并促进肿瘤发展相关基因的转录活性，也是肿瘤晚期、高Gleason评分、转移以及短生存时间的因素[41]。ERG的SE相关的谱系特异性机制与前列腺癌特异性转录因子FOXA1和HOXB13相关，通过物理互作协同作用。其机制是通过BRG1相关的染色质重塑复合物来建立SE染色质可及性和转录调节从而部分增加SE的活性[18]。此外，ERG还能与BRD4互作并共定位在许多细胞增殖和侵袭相关的靶基因上。最近研究在前列腺癌中发现ERG下游靶点CBP/p300作用转录激活子2(CTTED2),可以促进p300和蛋白精氨酸易位，并与核仁形成多聚复合物刺激细胞迁移并最终导致前列腺癌转移。

2.4 FOXA1 FOXA1是前列腺癌发生发展的因子，其编码的先锋因子可以打开染色质增加AR的可及性，使得FOXA2直接与AR互作产生AR信号，从而驱动癌细胞的生长和存活[42-43]。另外还能通过非AR依赖途径发挥作用。FOXA1不能与Wnt通路抑制因子TLE3互相作用，进而激活Wnt通路增加癌细胞的侵袭和转移能力[44]。因此，靶向FOXA1调控通路将为前列腺癌的治疗提供一种新的思路。

2.5 LncRNA/eRNA eRNA是一类由SE转录生成的非编码RNA，它能通过多种方式调控增强子活性以及相关基因的转录。顺式eRNA可以通过去除NELF并激活p-TEFb复合物，从而增加RNA pII的延长，正性调节邻近mRNA。随着对eRNA的研究增多，有研究人员发现反式eRNA也能发挥功能[45-46]，反式eRNA可以将DNMT1募集到PSA等基因末端区域并增加其5mC甲基化水平。其机制在于碳C富集区域是反式eRNA结合DNMT1并发挥功能的关键。通过细胞实验证实，AR与反式eRNA存在关联，因此进一步探究其互作关系将有助于寻找新的治疗方式。

此外，最近关于前列腺癌的研究发现，FOXA1驱动的SE激活LncRNA DSCAM_AS1的表达，DSCAM_AS1能与YBX1互作影响YBX1募集到启动子上FOXA1区域，从而促进前列腺癌的进展[47]。LncRNA MANCR在PC3中选择性表达，并能增加癌细胞的迁移和侵袭能力[48]。此外，在膀胱癌中新发现的LncRNA LINC00162能促进肿瘤的进展，其机制是结合转录调节蛋白THRAP3抑制PTTG1IP的表达从而促进细胞增殖[49]。

3 靶向SE治疗前列腺癌

前列腺癌治疗核心是抑制AR驱动的癌基因信号及下游转录。多年来，AR途径已成功用于早期和晚期前列腺癌的治疗，最初采用手术和化学阉割，ADT是治疗首选，但常发生去势抵抗。故ADT联合AR抑制剂治疗转移性或非转移性前列腺癌成为研究热点。(表1)

表1 前列腺癌中靶向SE相关因子药物

Darolutamide被用于治疗具有高风险进展为转移性疾病的患有非转移性趋势抵抗性前列腺癌的男性患者[50]。它对AR配体具有高亲和力，结合后能阻断AR的同源二聚化，抑制AR进入细胞核从而降低雄激素靶基因的表达及前列腺癌细胞的增殖。此外，它还能通过减少FOXA1与AR结合发挥药效。但是，AR信号抑制剂对前列腺患者生存质量带来的益处有限，因此需要探索新的治疗靶点。

THZ531是CDK12的共价抑制剂，最早用于T细胞淋巴瘤，其作用机制是下调AR信号并优先抑制CDK12抑制敏感转录子(CDK12-ISTs)，包括前列腺癌谱系特异性基因，以及促进细胞存活。研究人员利用CRISPR/Cas9对激酶进行筛选发现CDK12是前列腺癌细胞存活的保守必需因子。[51]此外，THZ531还能与AR拮抗剂协同作用，其协同效应可能是由于AR靶点H3K27ac信号减弱及SE相关凋亡通路强化所致。因此，Darolutamide联合THZ531治疗是否可行，仍有待探究。

THZ1选择性共价结合抑制CDK7磷酸化从而减弱AR信号且在CRPC和Enzalutamide抵抗前列腺癌细胞中维持效益。进一步研究表明，该药可以选择性靶向SE驱动的转录过程，包括MYC依赖的转录放大过程以及其他肿瘤特异性癌基因TFs和信号分子的表达过程[52-53]。THZ2能促进前列腺癌细胞的增殖和侵袭，与前列腺癌不良预后相关，在许多肿瘤中过表达，已成为潜在治疗靶点，许多相关抑制剂的临床试验已经进行[54]。

Enzalutamide是配体结合域的结合子，能有效阻断前列腺癌中AR的结合与激活。但一些患者在治疗一段时间后出现Enzalutamide抵抗。在Enzalutamide抵抗前列腺癌中，AR-V7表达升高，KI-ARv-03可以靶向CDK9导致AR-V7磷酸化降低，从根本上调节AR及AR-V7依赖的转录[32]。

Triptolide是雷公藤中提取的活性成分，具有抗前列腺癌作用。其机制是通过抑制AR磷酸化和AR-V7从而抑制AR结合到靶基因启动子上，并减少TFIIH和RNA PII 的募集，使癌基因转录被抑制来达到抗癌目的。此外，在CRPC小鼠异种移植实验中发现，低剂量Triptolide还能与Enzalutamide协同作用增加Enzalutamide的抗癌效果。这使得Triptolide成为潜在CRPC治疗药物。[26]

JQ1通过抑制BRD4与H3K27ac来抑制SE与启动子互作，从而改变肿瘤基因转录而抗增殖。其作用靶点是LncRNA MANCR，RNA-seq分析显示，在敲低MANCR后，癌细胞迁移和侵袭相关基因的表达发生了改变[48]。AR(-)的CRPC具有高度的侵袭和耐药能力，JQ1能抑制前列腺癌细胞的恶性表型，在异种移植小鼠模型中，JQ1较Enzalutamide表现出更强的拮抗效果[55]。其抗肿瘤作用在膀胱癌中也得到了验证[56]。

4 结语及展望

综上所述，SE及其调控的相关分子在疾病的发生发展的关键节点发挥调控作用，检测这些分子将有助于疾病的诊断及预后判断，比如前列腺癌kinedin超家族蛋白4A(KIF4A)可作为前列腺癌预后标志物[57]。相比治疗，肿瘤的诊断在肿瘤诊治中更为重要。目前主要依赖组织活检及影像学检测确诊，肿瘤液体活检(如血浆循环游离DNA)的应用及发展，提高了诊断的特异性及敏感性[58]。将二代测序技术与之相结合，有望实现更准确的肿瘤诊断并为治疗提供更准确的方向。亦或对SE相关因子深入探究，可能发现新的作用靶点，如潜在靶点DSCAM_AS1，为靶向药物的选用及开发提供了依据。在一种疾病中可能有多个SE相关因子参与，联合用药或老药新用也值得进一步探究。