钙磷蛋白表达在预测乳腺癌预后中的价值

陈秀， 李蕾， 张鹤达， 张建

乳腺癌是女性健康的首位杀手，每年发病率和死亡率遥遥领先[1]。目前乳腺癌的治疗方法主要为手术治疗、化学治疗、靶向治疗、免疫治疗等综合治疗，随着新技术、新药物的研发，乳腺癌患者的生存率有所提高，但仍有20%～30%的患者会出现远处转移相关性死亡[2]。乳腺癌发生发展的复杂机制和肿瘤特异性或分期特异性标志物的缺失进一步加大了治疗的难度。

骨转移是乳腺癌最常见的远处转移，已知乳腺癌骨转移的主要病理生理基础是肿瘤细胞促进骨组织中钙离子的释放，破坏了成骨细胞和破骨细胞之间的生理平衡[3]。钙磷蛋白(calcyphosine，CAPS)是一种钙结合蛋白家族成员，参与了钙离子的转运过程，在肿瘤骨转移的过程中发挥重要的作用。近来大量研究发现骨微环境中的免疫细胞和免疫相关因子主要与成骨细胞相互作用维持“骨平衡”，当各种因素导致骨微环境中免疫细胞功能缺陷时，会促使肿瘤骨转移的发生[4]。同时有学者证实了肿瘤微环境中免疫细胞的高密度浸润对乳腺癌患者的骨转移及预后具有明确的相关性[5]，由此探究肿瘤微环境相关免疫细胞与骨微环境之间的联系为乳腺癌的治疗开辟了新方向。然而，CAPS与乳腺癌微环境相关免疫细胞之间是否具有关联尚无研究。

本研究通过分析CAPS在乳腺癌患者中的表达情况及与肿瘤相关免疫细胞的关系，探讨CAPS在乳腺癌预后评估中的临床价值及作为治疗靶标的可能性。

1 资料与方法

1.1 UALCAN数据库分析 UALCAN数据库(http：//ualcan. path. uab. edu)中涵盖了TCGA数据库中31种恶性肿瘤的RNA-seq结果和临床资料[6]，我们通过该数据库分析乳腺癌组织和癌旁组织中基因的表达水平，以及在不同肿瘤分级、分期等临床病理特征条件下基因的表达情况。

1.2 LinkedOmics LinkedOmics(http：//www.linkedomics.org/login.php)是分析TCGA数据库中32个肿瘤相关多维数据集的一个平台[7]。使用Pearson相关分析统计出CAPS的相关基因，并以火山图、热图或散点图展示。LinkedOmics平台使用基因富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)计算出基因生理过程(GO_BP)、KEGG信号通路、激酶-靶点、miRNA-靶点、转录因子-靶点富集分析，FDR<0.05的相关基因会展示在图表中。

1.3 Kaplan-Meier Plotter生存分析 Kaplan-Meier Plotter网站罗列了18 674个恶性肿瘤样本(7 830例乳腺癌)患者，我们通过该网站分析CAPS与乳腺癌预后的关系。CAPS检测探针ID为226424_at。样本根据CAPS的表达量分为低表达组和高表达组，通过K-M生存曲线和Log-rank方法分析基因和总生存期(overall survival，OS)、无复发生存期(relapse free survival，RFS)、无远处转移生存期(distant metastasis free survival，DMFS)的关系，并计算对应的风险病例数、风险比(hazard ratios，HRs)、95%可信区间(confident intervals，CIs)、P值。P<0.05为差异具有统计学意义。

1.4 TIMER2.0 TIMER(https：//cistrome. shinyapps. io/timer/)能够对TCGA数据库中不同恶性肿瘤的免疫微环境进行系统性分析，其囊括了32种恶性肿瘤的10 897样本[8-9]。TIMER应用反卷积法[10]反映肿瘤相关浸润免疫细胞的数量(tumor-infiltrating immune cells，TIICs)。我们分析了乳腺癌患者CAPS和B细胞、CD4+ T淋巴细胞、CD8+ T淋巴细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、树突细胞等免疫细胞及与肿瘤纯度的关系。

2 结果

2.1 乳腺癌组织与癌旁组织中CAPS的表达量比较TCGA数据库中统计了1 076个乳腺癌组织样本和114个癌旁组织样本中标准化后CAPS基因的表达量，发现CAPS基因在乳腺癌组织的中位表达量为4.865/107，较癌旁组织中位表达量的3.146/107，呈现出明显的高表达(图1A)。CPTAC数据库中统计了125个癌组织样本CAPS蛋白表达量比18个癌旁组织样本表达量高(图1B)。因此，CPAS基因和蛋白均可以作为乳腺癌的潜在诊断因子。

*：P<0.05图1 CAPS在乳腺癌组织与正常组织中的表达水平

2.2 不同亚组乳腺癌中CAPS的表达量比较 基于临床病理学特征的多样性，我们使用UALCAN数据库分析了TCGA-BRCA和CPTAC-BRCA中不同亚组患者体内CAPS的基因和蛋白水平表达量，发现肿瘤分级、人种、性别、年龄、月经状态、分子分型、病理类型等亚组中，CAPS的表达量与对照组存在显著性差异(图2～3)。因此CAPS有希望作为判断乳腺癌患者亚组甚至预后的潜在预测因子。

*：P<0.05图2 不同亚组中CAPS基因的表达水平

*：P<0.05图3 不同亚组中CAPS蛋白的表达水平

2.3 生存分析 使用Kaplan-Meier生存曲线分析TCGA数据库中乳腺癌患者预后情况和CAPS的关系，根据CAPS的中位数将患者分为高表达组和低表达组，分析发现CAPS高表达组乳腺癌患者的OS、RFS、DMFS均较短(图4，log-rank testP<0.05)。通过GO、KEGG分析发现CAPS可能参与人体的免疫调节。

注：OS为完全生存期；RFS为无复发生存期；DMFS为无远处转移生存期；HR为风险比图4 CAPS与乳腺癌OS、RFS、DMFS的生存曲线

2.4 免疫相关性 我们使用TIMER数据库分析了CAPS与乳腺癌免疫微环境的关系，结果发现CAPS不仅与乳腺癌肿瘤纯度相关(r=0.086，P<0.05)，而且与肿瘤微环境中的主要免疫细胞相关(图5)。

图5 CAPS与乳腺癌浸润相关免疫细胞的关系

3 讨论

乳腺癌骨转移是乳腺癌诊疗过程中我们面临的巨大挑战，而骨转移的病理生理机制主要是肿瘤细胞及肿瘤微环境阻碍了骨的生成和骨的破坏之间的动态平衡，在这个过程当中钙的代谢发挥着举足轻重的作用。钙结合蛋白是细胞第二信使系统的重要组成部分，密切参与了钙离子的转运过程，而CAPS作为钙结合蛋白家族的成员，参与了钙离子代谢的调节作用，从而进一步加速骨转移的过程。

有研究收集了36例结直肠癌患者的癌组织和癌旁组织，发现癌组织中CAPS的含量显著高于癌旁正常组织，然后结合临床病理学特征分析发现CAPS的表达水平与结直肠癌患者的组织分级、侵袭深度、淋巴结转移、远处转移息息相关，因此推断CAPS高表达可能预测结直肠癌患者的不良预后[11]。同时，CAPS的表达与非小细胞肺癌患者发生骨转移密切相关，高水平的CAPS可能促进非小细胞肺癌的转移能力[12]。然而在肺腺癌中，研究发现CAPS的表达量明显低于正常肺组织，并且在发生骨转移的肺腺癌患者中，CAPS低水平者的生存期更长[13]。由此我们推断CAPS在不同实体肿瘤中可能发挥不同的调节作用，本研究旨在探索CAPS是否参与了乳腺癌的发生发展过程。

本研究中，我们发现乳腺癌组织中CAPS的基因和蛋白表达量远高于癌旁正常组织，且高表达CAPS的乳腺癌患者生存期较短，我们推断CAPS参与了乳腺癌的发生和发展。而不同肿瘤分期患者之间CAPS的基因和蛋白表达水平差异没有统计学意义，分析其中原因可能是由于各个肿瘤分期的患者人数较少且不均质，缺乏可比性，因此CAPS是否具有预测不良肿瘤分期的作用还需要更多的大样本临床研究来佐证。在不同人种之间CAPS的比较可以得出结论：黑人乳腺癌患者的CAPS基因表达水平高于白种人和黄种人患者。这与黑人乳腺癌患者的预后相对较差相一致[14]，侧面证实了CAPS有评估乳腺癌患者预后的功能。在不同年龄段患者之间的比较发现：41～60岁患者中CAPS的基因表达明显高于21～40岁患者，而与>60岁患者之间差异无统计学意义，并且不同年龄段之间CAPS基因的表达未发现显著差异性，由此我们推测在不同年龄段患者中CAPS蛋白的诊断价值可能高于预后评估价值。同时我们发现围绝经期患者的CAPS基因表达低于绝经前和绝经后患者，可能与纳入研究的围绝经期患者数量较少有关，而不同月经状态下的CAPS蛋白水平的研究数据尚欠缺，同时考虑到基因只有在转录翻译成蛋白分子后才发挥生理作用，因此该结论有待进一步研究证实。不同分子分型亚组分析中，luminal型患者CAPS基因表达较三阴型患者低，尤其低于BL1型和M型三阴型乳腺癌患者。考虑到纳入蛋白层面研究的病例数较少，不同分子类型间CAPS蛋白水平的差异性无统计学意义。病理类型亚组分析中，由于组间数量的偏差性导致结论的可靠性有所欠缺，但CAPS蛋白在正常组织和IDC之间的差异性仍具有极高的可信度。

目前肿瘤微环境的调控已成为打破乳腺癌治疗瓶颈的关键，肿瘤相关免疫细胞的功能与乳腺癌患者的预后息息相关[15]，这与本研究中高水平CD4+ T细胞乳腺癌患者生存期较长的结果相一致。针对接受内分泌治疗的激素受体阳性乳腺癌患者，约三分之一会因为耐药性而使疗效大打折扣[16]。有研究者将内分泌治疗耐药患者和内分泌治疗敏感患者的乳腺癌组织中蛋白分子表达进行了比较，发现CAPS高表达的乳腺癌患者更容易发生内分泌治疗的耐药性，具有一定程度的预测功能[17]。结合本研究中，在激素受体阳性患者中CAPS与免疫细胞的关系，尤其是与T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞的负相关关系，由此推断CAPS可能通过抑制Luminal型乳腺癌患者体内的免疫细胞功能从而诱导内分泌药物耐药性的产生，最终影响患者的预后。

综上，我们认为CAPS可以作为乳腺癌诊断的潜在分子标志物，并且CAPS可能通过调节肿瘤相关免疫细胞的功能导致乳腺癌的不良预后，尤其与激素受体阳性乳腺癌患者的预后紧密相关。