一例丹顶鹤幼鹤血液原虫致死病例报告

赵素芬 王运盛 李婧伦 蒋 鹏 滑 荣 张 欢 胡 昕 詹同彤 李 茹* 卢 岩*

(1.北京动物园管理处，圈养野生动物技术北京市重点实验室，北京，100044；2.大连森林动物园有限公司，大连，116013)

丹顶鹤(Grusjaponensis)为鹤科(Gruidae)鹤属的大型涉禽，我国一级重点保护野生动物[1]，IUCN易危(VU)物种(https：//www.iucnredlist.org/search？query=Grus%20japonensis&searchType=species)，CITES附录Ⅰ物种。截至2019年12月，我国28个省级行政区的90个圈养单位饲有丹顶鹤，圈养种群数量总计2 386只[2]，丹顶鹤饲养保护工作取得了长足的发展。然而近些年，我国多地动物园及自然保护区出现丹顶鹤及其他珍稀鹤类突然发病死亡，濒死前进行血液学检查，发现血液内寄生大量原虫，对病原进行形态学鉴定，疑似为疟原虫科(Plasmodiidae)的住白细胞原虫(Leucocytozoonsp.)。2020年，大连某动物园1只119日龄丹顶鹤幼鹤发病，治疗1 d后死亡，经尸体剖检、实验室检查和病理学检查，分析该病例死于血液原虫感染，现将病例报告如下。

1 材料与方法

1.1 发病动物情况

患病丹顶鹤为人工育雏鹤，30日龄后与同年繁育幼鹤合笼饲养，饲养笼舍与成年鹤笼舍相邻。该丹顶鹤发病前1 d采食量减少，发病当日精神沉郁、排绿色水样便，采集粪便样品，使用直接镜检法进行便常规检查，肌内注射头孢曲松钠和阿米卡星。治疗无效，次日死亡。

1.2 试验方法

1.2.1 剖检及病理组织学检查

剖检发病死亡的丹顶鹤，观察其病理变化。采集心、肝、脾、肺、肾和肠等组织，迅速投入10%的福尔马林液，进行病理石蜡切片前处理；同时，使用无菌锋利刀片剖开肝脏，清洁载玻片轻触新鲜剖面，制备肝组织印片，自然风干，用甲醇固定。

1.2.2 瑞氏吉姆萨染色

使用瑞氏吉姆萨染液染色肝组织印片15 min；双蒸水漂浮，流水冲洗，风干，在光学显微镜下观察。

1.2.3 HE染色

石蜡切片分别经二甲苯脱蜡，100%、95%、85%、75%、50%乙醇梯度复水，下行至双蒸水中，苏木精染色15 min，1%盐酸乙醇分色数秒，水洗返蓝15 min；再依次通过50%、75%、85%、95%乙醇梯度脱水后，伊红染色1 min，95%乙醇洗涤，再经无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光学显微镜下观察组织病理学变化情况。

1.2.4 细菌分离培养

采集死亡丹顶鹤心、肝、肾和脾，无菌条件下使用直接划线法接种于哥伦比亚血琼脂培养基，37 ℃恒温培养48 h。

2 结果与分析

2.1 剖检病变

死亡丹顶鹤尸僵完全，机体消瘦(图1A)。心外膜表面散在大量出血点，心耳水肿(图1B)；肝肿大，表面散在分布大量的、界限清晰的、圆形的、大小不一的出血点及灰白色小结节(图1C)；脾肿大，表面有点状出血(图1D)；肾肿大、质脆(图1E)；小肠肿胀，切面外翻，黏膜面有散在出血点(图1F)；直肠轻度水肿，出血。其余脏器眼观未见异常。

图1 丹顶鹤临床剖检结果

2.2 病原形态

瑞氏吉姆萨染液染色，肝组织印片内可观察到大量寄生于细胞内的、蓝染的、直径6～14 μm、不同发育状态的、圆形或椭圆形的虫体，游离于细胞的虫体多呈棒状或香蕉状(图2)。

图2 丹顶鹤肝组织印片

2.3 病理学检查结果

心：低倍镜下观察，可见心肌大面积坏死、心肌萎缩，炎性细胞浸润，心肌水肿，肌纤维间隙增宽；高倍镜下观察，肌纤维间隙及血管内散在大量寄生于细胞内的、蓝染的、直径6～14 μm、呈圆形、椭圆形或香蕉状的虫体(图3A)。

肺：低倍镜下观察，肺组织出血、淤血，肺内出现大面积蓝染坏死区域；高倍镜下观察，肺泡壁毛细血管扩张、淤血，血管腔内可见大量纤维素及红细胞，肺泡壁及血管腔内可见大量蓝染虫体寄生，坏死区域边缘寄生大量虫体(图3B)。

肾：低倍镜下观察，肾组织大面积水肿，肾小管失去固有结构；高倍镜下观察，肾小管上皮细胞变性、脱落和坏死，间质可见大量虫体寄生(图3C)。

肝：低倍镜下观察，肝大面积坏死、蓝染，肝淤血，中央静脉内蓄积大量血液，肝索紊乱，失去固有结构；高倍镜下观察，肝细胞崩解，细胞间隙及肝血窦内可见大量蓝染虫体(图3D)。

脾：低倍镜下观察，脾组织出现大面积坏死区域；高倍镜下观察，大量蓝染虫体寄生(图3E)。

肠：肠绒毛固有层内可见大量虫体寄生(图3F)。

图3 丹顶鹤主要脏器病理学观察结果

2.4 粪便常规

直接镜检法检查丹顶鹤粪便样品内寄生虫和潜血等，高倍镜下观察，未见白细胞和红细胞，蛔虫卵、滴虫滋养体极少观察到(表1)。

表1 丹顶鹤粪便常规检测结果

2.5 细菌分离培养

采集死亡丹顶鹤心、肝、肾和脾，无菌条件下使用直接划线法接种于哥伦比亚血琼脂培养基，经37 ℃恒温培养，24、48 h后均无细菌生长。

3 诊断

根据肝组织印片、病理剖检结论及实验室检验结果，确认该丹顶鹤因血液原虫感染致死。

4 讨论

本病例在发病时未采集血液进行血涂片检查，但通过临床症状、病理学检查及临床经验，该鹤与近些年我国多地动物园及自然保护区出现丹顶鹤及其他珍稀鹤类死亡病因相同，为血液原虫感染致死。病原在体内大量复制增殖，随着病程发展，病原随血液扩散至机体各个脏器，引起机体损伤，伴发寄生虫性坏死，并继发实质性心肌炎，同时该病原寄生于红细胞及白细胞内，引起动物贫血及免疫功能下降，甚至产生大量毒素，从而造成动物死亡。根据虫体形态学结构，分析该致病原可能隶属于顶复亚门(Apicomplexa)，孢子虫纲(Sporozoa)，球虫亚纲(Coccidia)，血孢子虫目(Haemosporidia)的住白细胞原虫；基于鸟类血孢子虫目常规引物进行套式PCR(第1轮扩增引物：HaemNF1，5′-CATATATTAAGAGAAITATGGAG-3′)；HaemNR3，5′-ATAGAAAGATAAGAAATACCATTC-3′。第2轮扩增引物：HaemF，5′-ATGGTGTTTTAGATACTTACATT-3′；HaemR2，5′-CATTATCTGGATGAGATAATGGIGC-3′)，未能扩增出该病原的Cytb基因片段，其基因特点、分子生物学鉴定及分类有待进一步研究。

据报道，住白细胞原虫的传播媒介为双翅目(Diptera)昆虫蚋(Simuliidae)和蠓(Ceratopogouidae)等，虫媒的活动习性使该病的发生呈明显的季节性，多发于夏秋季，在雨季过后20 d左右开始发生，当气温高于20 ℃时，蠓的繁殖及活动最为活跃，该病的流行性明显增加[3-4]。大连市2020年气温偏高，降水偏多，8月出现6次区域性暴雨、大暴雨和大风天气，9月出现4次强对流天气，降水量超同期。该鹤于2020年8月7日出壳，气温适宜虫媒活动，合笼后饲养的笼舍环境易积水，利于虫媒繁殖栖息，可能使该丹顶鹤在易感季节被叮咬感染。禽类对该病原的易感性与日龄成正比，危害程度随年龄增加呈下降趋势；幼禽感染后死亡率高，成年禽通常无明显临床症状，部分可耐过，死亡率较低[5]。该丹顶鹤病例为幼龄鹤，于119日龄开始出现症状，病程快，隔天即死亡，死亡时间正值秋冬换季时节，推测为气温突变等外界因素造成机体抵抗力下降，诱发感染病原在体内大量增殖，从而引起动物发病死亡。其他饲养单位亦有类似大连某动物园病例在秋冬季节发生死亡的情况。此外，幼鹤发病后排绿色水样便，剖检多脏器出血，肝表面可观察到大量的灰白色病灶，这与禽霍乱症状相似，但临床上极少报道丹顶鹤发生霍乱致死，住白细胞原虫病导致幼鹤肝表面散布坏死灶，而非呈弥散性坏死，剖检时需注意区分。

治疗住白细胞原虫感染的药物通常可选择磺胺二甲嘧啶、乙胺嘧啶和二氯二甲吡啶酚等[6-7]。贾婷[8]研究发现，目前治疗血液原虫的药物对鹤的治疗效果欠佳，肌内注射青蒿琥酯能够在一段时间内控制病情，但之后血液学检查发现，感染寄生虫的血细胞数量会突然上升，随即动物死亡，未来药物治疗研究仍是工作重点。目前，对于鹤类血液原虫病仍以预防为主，在虫媒活动频繁的季节应及时清理笼舍周边的杂草、树丛和积水，做好消毒工作，保持笼舍卫生，减少吸血昆虫孳生；亦可使用杀虫剂如溴氰菊酯、戊酸氰醚酯和蝇毒磷等在笼舍周围喷洒杀灭媒介昆虫[9-10]，有条件的笼舍建议安装防蚊虫纱网，切断传播媒介[11]。在进入血液原虫流行季节前，可在日粮中添加多种维生素以提高机体抵抗力。