粪便显微分析和DNA宏条形码技术在野猪食性分析中的应用和比较

宫 爽 张 萍，2 栾 雪，3 包 衡 姜广顺，4*

(1.东北林业大学野生动物与自然保护地学院，哈尔滨，150040；2.南江县林业局，南江，635600；3.杭州禹创企业服务有限公司，杭州，310000；4.国家林业和草原局猫科动物研究中心，哈尔滨，150040)

有蹄类动物食性研究的精确性与资源管理有直接关系[1]，可评估营养容纳量，对种群管理和种间关系等生态学问题探讨提供有价值的信息[2-3]。食物选择性是指动物出于某些目的，对取食生境中存在的食物种类进行选择，食物选择的过程与结果是非常复杂的，与食物的丰盛度、形态学特征、气味、适口性、营养价值及消化生理等因素有关[4-5]。目前，食性分析的方法有很多，主要包括粪便显微分析法、DNA条形码分析法、胃分析法、直接观察法、取食地点检查法和啃食调查法等[6-11]。

粪便显微分析法使用范围比较广泛[12]，优点是非损伤性取样，对动物干扰性小，粪便样品容易收集；缺点是有些植物角质细胞经动物消化后用显微镜很难区分辨认，造成粪便中有些采食物种比例增大或减小的情况，制片过程中化学试剂的影响，粪便显微分析也会出现实际取食比例减少的情形；此外，粪便显微分析结果会受到镜检方法和镜检人员对植物角质细胞主观认知差异等因素的影响。粪便显微镜检方法包括频率转换法、点样方法、直接计数法、面积法与截线法，其中频率转换法最节省时间，点样方法估计效果最好，镜检时常选择这两种方法[13]。

近些年来，应用DNA条形码技术分析野生动物食性备受关注[14-15]，优点是工作量小、数据量大、灵敏度高，捕获出现频次较低的DNA序列，即较少取食食物也可被定量化；分类更加精细，精确到种级别的分类单元；但缺点是成本高、步骤繁多，不可控因素对分析结果的准确性产生影响，如从粪便样品中提取的DNA会发生一定程度的降解情况。DNA条形码长度过长，PCR扩增时效果较差；DNA条形码长度过短，识别精度又会下降。因地理分布的差异性，DNA分析使用的公共数据库仅收录了局部范围内的部分DNA条形码，造成了分类精度下降，无法满足不同区域食性研究的需要[16]。

野猪(Susscrofa)是一种中型哺乳动物，对于环境有很强的适应性，分布广泛，杂食性物种，在生态系统中处于重要地位。本试验在区域尺度上利用粪便显微分析法和DNA宏条形码技术对野猪植物性食性进行研究，尽可能消除地理因素对食性分析方法统计结果的差异性；通过比较两种方法的优缺点，明确粪便显微分析法和DNA宏条形码技术在食性结果上的差异与一致性，为有蹄类动物食性研究的方法选择提供方法学依据。

1 研究区概况

选择珲春东北虎国家级自然保护区、汪清国家级自然保护区、黄泥河国家级自然保护区、天桥岭林业局和穆棱东北红豆杉国家级自然保护区作为研究地区，位于长白山北部林区老爷岭南和张广才岭南附近。老爷岭位于黑龙江省东南部和吉林省东部，为长白山支脉，海拔600～1 000 m，年平均气温2.3～3.5 ℃；张广才岭位于中国东北地区东部山地北段的中轴部位，是兴安岭山系长白山的支脉，平均海拔约800 m，年平均气温2.3～3.7 ℃，植被类型主要为红松(Pinuskoraiensis)、云杉(Piceaasperata)及阔叶树组成的针阔混交林和灌丛等。

2 材料与方法

2.1 样本采集

2014年12月—2016年3月，采用冬季雪地足迹跟踪方法在珲春、汪清、黄泥河、天桥岭和穆棱地区，收集野猪新鲜粪便(≤24 h)和可取食食物样本，每条足迹链长度保证在3 km以上。为避免个体重复，每条足迹链上收集1～3份粪便样品，带回的粪便样本及时放入冰箱内-20 ℃保存，以便进一步分析。

2.2 粪便显微分析法

将新鲜的野猪粪便样本和植物样本放于档案袋中，在烘箱里70 ℃烘48 h至恒重后粉碎研磨，粉碎后取小于40目的过筛物且大于100目的筛上物进行后续处理。选取过筛后的粪便样本或植物样本约0.5 g放置于培养皿中，加入10%次氯酸钠溶液，体积约占培养皿体积的2/3，用清洗干净的镊子在培养皿中缓慢搅拌，搅拌后浸泡3 h以上，使其充分消化。样品消化结束后，样品和消化液一起倒在100目的网筛上，用蒸馏水充分冲洗去除消化液，样品冲洗干净后放回干净的培养皿中准备制片。在载玻片上滴一滴甘油，用镊子夹取少量样品放置于载玻片上的甘油中，使样品分布均匀，将载玻片放在10×10倍的显微镜下观察，确保细胞结构清晰后，盖上盖玻片封片，用中性树胶封边，再放到物镜为20倍的显微镜下仔细辨认，每种植物样本制作2～4个装片在显微数码照相机下拍照用于对照辨认。

镜检时采用频率转换法统计野猪取食物种的组成比例，每个玻片镜检的方向为从左向右，从上到下，辨认野猪取食植物种类和记录每种植物被拍摄的次数。根据频率转换公式计算：

F=100(1-e-D)

(1)

D=ln[1/(1-F)]

(2)

DR=D/∑D×100%

(3)

式中：F为每个粪便玻片中每种植物可辨认角质细胞的出现频率；D为每种植物可识别表皮角质细胞碎片的密度；DR为野猪采食的每种植物实际组成比例的估计值，即野猪主要食物组成比例。

2.3 DNA宏条形码分析法

从野猪的新鲜粪便中提取采食物种的DNA，粪便的新鲜程度是决定DNA质量的关键，利用DNA条形码食性分析的基本原理是基于粪便中的DNA来自不同取食种类其条形码区域不同。测序服务由上海派森诺生物科技股份有限公司提供，设计选择高通用性和高分辨率的DNA条形码引物，利用PCR技术扩增某段特异性片段，选用引物Z1aF(5′-ATGTCACCACCAACAGAGACTAAAGC-3′)和hp2R(5′-CGTCCTTTGTAACGATCAAG-3′)对食物叶绿体rbcL区扩增，PCR采用NEB Q5 DNA高保真聚合酶0.25 μL，5×Reaction Buffer和5×High GC Buffer各5.00 μL，2.00 μL的dNTP(2.5 mmol/L)，2.00 μL的模板DNA，引物(10 μmol/L)各1.00 μL，8.75 μL的无核酸水。PCR反应程序：98 ℃预变性2 min；98 ℃变性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25个循环；72 ℃延伸5 min。

PCR扩增产物用Agencourt AMPure Beads试剂盒(贝克曼库尔特有限公司)纯化回收，使用PicoGreen dsDNA Assay Kit(美国英杰生命技术有限公司)进行定量。定量步骤完成后，采用双端测序法(paired-end sequencing)，由Illumina MiSeq系统(上海派森诺生物科技股份有限公司)完成测序，测序结果进行序列拼接、清除冗余序列、降噪和序列分类等步骤，完成序列整理与分析，经过筛选和数据库对比DNA测序序列，通过序列的相似性判断对应的食物种类，判断物种的标准为：对比结果一致度不低于97%时，最匹配序列只对应单一的植物物种，该物种在当地有分布时，认为序列来自该物种；如最匹配序列对应多个植物物种，需要排除在当地没有分布的物种，如仍对应不止一种，则鉴定结果即包含这些物种的最小分类单元。

根据高通量测序得出的食物DNA序列数，定量野猪取食物种所占比例。DNA条形码数据库构建步骤：在目标动物的觅食地区，收集可能被取食食物物种的组织材料，提取这些物种的DNA合成相应的引物，创建潜在食源DNA条形码的数据库。

2.4 数据的统计分析

食物多样性分析采用物种丰富度指数(D)，Shannon-Wiener指数(H′)，均匀度指数(J′)，生态位宽度(B)，计算公式如下：

D=(S-1)/lnN

(4)

(5)

J′=H′/lnS

(6)

(7)

式中：S为野猪某粪便样品中物种总数目；N为野猪某粪便样品中包含的所有物种总个体数目；Pi为野猪某粪便样品中植物i在这份粪便所占的比例。

使用SPSS软件进行两独立样本Mann-WhitneyU检验，比较粪便显微分析和DNA宏条形码技术在不同地区的物种丰富度指数、Shannon-Wiener指数、均匀度指数和生态位宽度的差异，P<0.05为差异显著。

3 结果与分析

3.1 野猪食性组成对比

在5个研究地区，共采集117份野猪新鲜粪便，其中珲春33份、汪清33份、黄泥河18份、天桥岭17份和穆棱16份。粪便样本中分离鉴定出的食物种类有枝条、芽、叶、果实、树皮、茎、根、草本、苔藓、其他(石头等)及动物组织。采用粪便显微分析方法，鉴定出的植物种类主要有薹草属(Carex)、松属(Pinus)、木贼属(Equisetum)、柳属(Salix)、杨属(Populus)、榆属(Ulmus)、槐属(Sophora)、榛属(Corylus)、栎属(Quercus)、槭属(Acer)、忍冬属(Lonicera)、梾木属(Swida)、卫矛属(Euonymus)、五加属(Acanthopanax)、丁香属(Syringa)、稠李属(Padus)、花楸属(Sorbus)、椴树属(Tilia)、胡桃属(Juglans)、苹果属(Malus)、桤木属(Alnus)、桦木属(Betula)、杜鹃花属(Rhododendron)、越桔属(Vaccinium)、溲疏属(Deutzia)、胡枝子属(Lespedeza)、猕猴桃属(Actinidia)、绣线菊属(Spiraea)、珍珠梅属(Sorbaria)、落叶松属(Larix)、蹄盖蕨属(Athyrium)和鳞毛蕨属(Dryopteris)32属。

采用粪便显微分析方法获得的食性结果中，总体上，比例大于4%的主要食物有木贼属(22.76±1.87)%、松属(22.56±1.73)%、薹草属(25.41±2.09)%和苔藓(Bryophyta，(4.95±1.02)%)。对每个地区采食植物相对密度大于4%的主要食物进行分析，其中在珲春地区，薹草属(38.92±4.76)%、松属(8.70±1.11)%、木贼属(8.63±2.09)%、苔藓(7.22±2.35)%、槭属(5.26±1.06)%和忍冬属(3.41±0.61)%是野猪的主要食物；在汪清地区，薹草属(39.9±4.53)%、松属(12.53±2.13)%、苔藓(9.91±2.95)%、忍冬属(6.58±1.61)%和槭属(5.38±1.56)%是野猪的主要食物；在黄泥河地区，松属(41.48±5.02)%、木贼属(34.25±4.30)%和薹草属(8.88±1.67)%是野猪的主要食物；在天桥岭地区，木贼属(41.95±2.53)%、松属(25.94±2.73)%、薹草属(13.69±1.66)%和蕨类(Pteridophyta，(6.13±1.03)%)是野猪的主要食物；在穆棱地区，木贼属(41.40±3.94)%、松属(39.19±5.00)%和薹草属(9.67±1.24)%是野猪的主要食物。

从珲春、汪清、黄泥河、天桥岭和穆棱5个地区各取4份野猪粪便进行DNA宏条形码技术分析，鉴定出的植物种类有薹草属、胡桃属、唐菖蒲属(Gladiolus)、栎属、牛蒡属(Arctium)、桤木属、蚊子草属(Filipendula)、槐属、桦木属、榛属、猕猴桃属、落花生属(Arachis)、槭属、木贼属、绣线菊属、珍珠梅属、落叶松属、松属、卫矛属、杨属、榆属、唐松草属(Thalictrum)、鹅耳枥属(Carpinus)、扁果草属(Isopyrum)、桑属(Morus)、李属(Prunus)、黄瓜属(Cucumis)、早熟禾属(Poa)、天仙子属(Hyoscyamus)、鹿蹄草属(Pyrola)、稻属(Oryza)、冷杉属(Abies)、铁线莲属(Clematis)、百合属(Lilium)、蝇子草属(Silene)、刺槐属(Robinia)、臭草属(Melica)、荨麻属(Urtica)、梣属(Fraxinus)、铁木属(Ostrya)、黄檗属(Phellodendron)、悬钩子属(Rubus)、鸢尾属(Iris)、委陵菜属(Potentilla)、针蔺属(Trichophorum)、仙女木属(Dryas)、旋覆花属(Inula)、拟耧斗菜属(Paraquilegia)、云杉属(Picea)、柞木属(Xylosma)、茄属(Solanum)、蒿属(Artemisia)、银莲花属(Anemone)、栒子属(Cotoneaster)、花椒属(Zanthoxylum)、山琉璃草属(Eritrichum)、黍属(Panicum)、蔷薇属(Rosa)、紫穗槐属(Amorpha)和荸荠属(Heleocharis)60属。

采用DNA宏条形码技术获得的食性结果中，总体上，比例大于4%的主要食物有薹草属(30.02±5.95)%、唐菖蒲属(18.76±4.12)%、胡桃属(6.63±3.84)%、蚊子草属(5.23±2.79)%、榛属(4.23±1.60)%和绣线菊属(4.93±4.06)%。对每个地区采食植物相对密度大于4%的主要食物进行说明，其中在珲春地区，薹草属(49.65±17.67)%、胡桃属(28.45±21.29)%、唐菖蒲属(4.88±1.53)%、蚊子草属(4.43±3.92)%和栎属(4.12±3.04)%是野猪的主要食物；在汪清地区，薹草属(47.70±25.09)%、唐菖蒲属(24.00±11.40)%、槭属(5.30±4.93)%、落花生属(5.23±5.21)%、榛属(4.96±4.92)%和胡桃属(4.09±4.08)%是野猪的主要食物；在黄泥河地区，唐菖蒲属(29.17±8.76)%、薹草属(21.62±4.78)%、槭属(7.76±2.89)%、榛属(7.60±3.81)%、木贼属(7.19±3.77)%、栎属(5.50±2.63)%和鹅耳枥属(4.34±3.78)%是野猪的主要食物；在天桥岭地区，蚊子草属(22.98±13.95)%、薹草属(16.87±11.65)%、牛蒡属(9.20±6.56)%、扁果草属(6.91±4.21)%、唐松草属(6.74±6.64)%、落花生属(4.82±2.80)%、桑属(4.53±2.79)%、绣线菊属(4.49±2.63)%和唐菖蒲属(4.47±2.71)%是野猪主要食物；在穆棱地区，绣线菊属(24.39±24.36)%、薹草属(22.69±9.57)%、唐菖蒲属(20.89±8.24)%和落花生属(12.24±4.56)%是野猪主要食物(图1)。

图1 粪便显微分析和DNA宏条形码技术获得的野猪食物组成

3.2 野猪食物多样性指数和生态位宽度

通过粪便显微分析和DNA宏条形码技术，探究冬季野猪在珲春、汪清、黄泥河、天桥岭和穆棱地区的食物物种丰富度、多样性、均匀度指数及生态位宽度差异。由粪便显微分析和DNA宏条形码技术分析预测的野猪食性计算得到的物种丰富度指数(图2A)，珲春、汪清和穆棱地区粪便显微分析得到的野猪食物物种丰富度显著高于DNA宏条形码技术分析得到的野猪食物物种丰富度(P<0.05)；Shannon-Wiener指数(图2B)：黄泥河地区粪便显微分析得到的野猪Shannon-Wiener指数显著低于DNA宏条形码技术分析得到的野猪Shannon-Wiener指数(P<0.05)；均匀度指数(图2C)：珲春地区粪便显微分析得到的野猪食物的均匀度指数显著高于DNA宏条形码技术分析得到的野猪食物的均匀度指数(P<0.05)；生态位宽度(图2D)：黄泥河地区粪便显微分析得到的野猪食物的生态位宽度显著低于DNA宏条形码技术分析得到的野猪食物的生态位宽度(P<0.05)。

图2 野猪食物多样性指数和生态位宽度

4 讨论

食性分析可为研究动物生存现状、营养状况和种间关系提供资料[17-22]。有蹄类食性分析通常采用粪便显微分析法，该方法对动物具有非损伤性，样品收集和保存十分方便。近年来，DNA宏条形码技术在食性分析中逐渐成熟和稳定，随着测序技术的不断发展，在有蹄类食性研究领域的使用更加广泛[23-25]。本研究通过粪便显微分析法和DNA宏条形码技术获得野猪主要食物种类和比例不同的情况。DNA宏条形码技术可以分析野猪的动物性食物，而粪便显微分析法无法分析野猪的动物性食物种类，因此，本研究未分析野猪动物性食物，仅对植物性食物对比研究。两种方法获得结果存在差异的主要原因可能无法确保粪便显微分析法的精准性。有一些学者认为，由于一些物种在种的级别难以区分表皮细胞特征差异，甚至有一些物种在属的级别也难以区分，动物本身消化作用也会对辨认度产生影响，这些因素均对食性分析结果造成影响[26-28]。本研究支持这一论点，通过粪便显微分析方法分析野猪食性，由于有些物种表皮细胞难以辨别，可能会出现食物类别鉴定不够全面乃至比例有变化的情况，如槭属和榛属的表皮细胞相似，又如栎属和桦木属的表皮细胞相似，这将增加辨认的难度。DNA宏条形码技术灵敏性较高，能识别出较少取食物种的DNA，使得食性分析更全面[29-31]，但也可能出现同种食物中不同细胞的DNA拷贝数存在差异，及不同食物DNA模板的PCR扩增效率存在差异等情况，造成测序产生的DNA序列数较多的食物，有可能野猪取食较少，序列数少的却有可能是野猪的主要食物[32]；DNA宏条形码技术需要构建潜在食源DNA条形码数据库，而现有的公共数据库中种类不全，只有局部范围的物种DNA条形码，可能无法满足食性分析的需要[33-37]。

本研究中通过粪便显微分析和DNA宏条形码技术分析获得的野猪食物类别不一致，及同一食物所占比例不同的情况，或是由于上述原因造成的。粪便显微分析结果显示5个地区野猪共取食32属植物，主要取食薹草属、松属、木贼属和苔藓；DNA宏条形码技术分析结果显示5个地区野猪共取食60属植物，主要取食薹草属、胡桃属、唐菖蒲属、蚊子草属、榛属和绣线菊属。显然，DNA宏条形码技术可辨认的食物类别会更全面，表明DNA宏条形码技术在定性分析食物类别上优于粪便显微分析。

粪便显微分析和DNA宏条形码技术都是使用动物粪便进行分析。使用粪便显微分析时，需尽可能采集动物活动范围内可利用的植物样本，通过与已知的植物角质细胞结构对比，更准确地确定粪便中食物种类和比例；使用DNA宏条形码技术时，需将获得的物种DNA序列与资源数据库内收录的物种DNA条形码进行对比判断种属，为避免资源数据库收录的物种DNA条形码不足，需要尽可能全面地建立动物潜在食源DNA条形码数据库。因此，粪便显微分析和DNA宏条形码技术两种方法存在一致性，均需要充分采集环境中可食用植物样本，建立全面的可食用植物角质细胞或DNA序列数据库，才可能获得精准的食性分析结果。

在欧洲和北美洲的森林中，野猪主要采食橡子、栗子、草本植物的地上部位和少许地下的根等，草本类植物占比较大，在资源匮乏的季节，野猪食物选择更多样化[38]；宋军等[39]在辽宁白石砬子保护区通过调查发现野猪主要采食蒙古栎(Quecusmongolica)果实、山葡萄(Vitisamurensis)果实、五味子(Schisandrachinensis)果实、玉蜀黍(Zeamays)和大豆(Glycinemax)等植物；王文等[40]在黑龙江通河乌龙狩猎场采用粪便显微分析法确定野猪主要食物种类为木贼(Equisetumhiemale)、红松、胡桃楸(Juglansmandshurica)、蒙古栎、稠李(Padusracemosa)、榛(Corylusheterophylla)、薹草和辽东楤木(Araliaelata)。本研究根据粪便显微分析法得出的野猪取食主要食物，和上述几个研究得出的野猪主要食性有部分相同，即野猪主要取食木贼、红松和薹草等物种，喜欢采食有果实类植物和草本类植物。由于野猪生活觅食地理环境不同，采食植物种类也会表现出一些差异，如在韩国雪岳山国立公园采用DNA条形码技术分析得知野猪主要取食蔷薇科(Rosaceae)和苔藓类植物，其中蔷薇科主要包括地榆属(Sanguisorba)、蚊子草属和李属[41]；而在美国3个州采用粪便DNA分析发现野猪主要采食壳斗科(Fagaceae)、苋科(Amaranthaceae)、禾本科(Poaceae)、菊科(Asteraceae)、伞形科(Umbelliferae)、柏科(Cupressaceae)、柳叶菜科(Onagraceae)、蓼科(Polygonaceae)、大麻科(Cannabaceae)和大戟科(Euphorbiaceae)等植物[42]。本研究根据DNA分析法得出的野猪采食种类数量较多，与上述两个野猪食性研究结果相似，都采食丰富的草本类植物。此外，野猪是机会主义杂食动物，饮食很大程度上取决于不同食物类型的相对可用性，不同季节野猪的食物选择也会发生变化[43]。在法国东南部的一个山谷中，野猪春季最重要食物是植物的绿色部分、根系和玉蜀黍，夏季以根茎和肉质果实为主，秋季以水果为主，冬季以肉质水果为主[44]，与本研究中野猪冬季食性有一定相似，都喜欢取食果实类植物物种。

基于上述结果，本研究认为采用粪便显微分析可能得出物种较少，尤其是草本类植物较少；而采用DNA宏条形码技术可能得出物种较多，尤其是草本类植物种类较多。因此，在分析有蹄类动物食性时，使用粪便显微分析法应收集全面的可食用植物的角质细胞结构，包括灌木、草本、苔藓和果实类，以便充分对照样本，减少辨认误差。使用DNA宏条形码技术时，应尽量丰富本地可利用食物的DNA条形码数据库，避免基础数据库和研究动物出现地域差异，从而对了解自然条件下食物种类和比例造成不利影响。