银耳多糖浸泡肉鸡种蛋对肉鸡鸡胚尿囊膜血管生成、雏鸡生长性能和抗氧化性能的影响

马维梅，郑玉才，李志雄，杨 佳，赖世雄，饶开晴

(西南民族大学畜牧兽医学院，四川成都 610041)

家禽与哺乳动物不同，其胚胎发育所需物质营养均来源于种蛋，而家禽卵黄的营养组成中碳水化合物占比很少。在鸡胚发育后期，鸡胚的肺呼吸和肌肉生长需要消耗大量能量，但残余的卵黄仅能满足维持需求，机体需动用机体储存的能量来满足生长发育，导致孵化期的弱雏率和死亡率升高，肠道发育迟缓，生长受阻。鸡胚发育后期，由于基础代谢增强，肺呼吸、转身及破壳等活动需要大量能量，而种蛋能量和营养物质的缺乏会限制孵化后期的鸡胚发育，降低种蛋的孵化性能。

近年相关研究表明，生命早期的营养状况可对动物机体组织、器官的结构和功能产生长期以致终生的程序化影响。种蛋浸泡是早期营养给予的一种方法，国内对于种蛋浸泡的最早研究是在1994年。研究发现，种蛋在入孵前用抗生素药液浸泡 20 min，可提高雏鸡出雏率和健雏率，维生素B浸泡种蛋可缩短其孵化时间。另有研究表明，黄芪多糖浸泡种蛋可以显著提高雏鸡血清和肝脏组织中谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)的活性，降低MDA的含量，从而提高雏鸡机体的抗氧化性能。

鸡胚在发育过程中，胚胎期血管生成情况可反映鸡胚的生长发育状况。研究发现，高原低氧环境下蛋内注射硫酸铜可提高胚胎期藏鸡和肉鸡鸡胚尿囊膜上血管生成相关基因VEGF的表达量，促进血管的生成，从而提高血液的运输效率。人类学相关研究也发现，VEGF基因表达量影响血管的发育，而且其基因表达量和血管数量及血管面积成正相关。另外，机体的生长发育是由生长激素及其受体GHR调控的。GHR广泛分布于全身，在肝脏中含量最高，其通过与靶器官上的受体结合诱导产生IGFs，进而调节机体的生长发育。研究发现，蛋内注射IGF-1可显著提高鸡胚胎期的胸肌和腿肌的生长发育和出雏后的饲料转化率。

银耳多糖(tremella polysaccharide，TP)是一种从银耳中提取的具有生物学活性的天然植物成分，主要由阿拉伯木糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、果糖和半乳糖等组成，具有促进动物生长性能、提高免疫力、改善肠道微生态、抗氧化、抗肿瘤等功能，且无毒副作用，其添加到饲料中在一定程度上能取代饲用抗生素。在孵化期间，由于鸡胚代谢率、氧气消耗的提高和组织多不饱和脂肪酸水平高，肉仔鸡胚胎对氧化应激的敏感性增强，胚胎会利用超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶等多种酶来对抗氧化应激。研究发现，对-半乳糖致亚急性衰老小鼠灌胃100、200、400 mg/kg体质量剂量银耳多糖溶液，小鼠血清、肝脏、脑组织中的SOD、过氧化氢酶(catalase，CAT)、GSH-Px和总抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)显著增强，且MDA含量的异常上升受到明显抑制，表现出较强的抗氧化活性。目前，银耳多糖相关的研究主要集中在多糖的提取及加工方式，对于其在生产中的相关研究多集中于人类学及猪和小鼠，但家禽相关的研究目前未见报道。因此，本研究旨在通过使用银耳多糖浸泡种蛋，来探讨其对鸡胚血管生成和雏鸡生长性能及抗氧化性能的影响，旨在为银耳多糖在家禽生产中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

132枚肉鸡种蛋，购买于富瑞康农业有限公司；银耳多糖纯度90%，购自上海源叶生物科技有限公司。试验于2021年1月12日至7月20日在西南民族大学动物医学实验室L2-222进行。

1.2 方法

1.2.1 种蛋的浸泡与孵化 挑选质量相近的132枚种蛋，随机分为3组，每组44枚种蛋，编号，称质量并记录。用75%乙醇消毒孵化盘及种蛋，钝端朝上放入孵化器进行常规孵化。孵化期间，温度和湿度的调控及翻蛋参照孵化器说明书进行设定。孵化至7胚龄时，分别采用0、20、40 mg/L银耳多糖溶液浸泡3组种蛋6 min，浸泡时间参照苏兰利方法，8、9胚龄时同样重复1次，浸泡后继续孵化。

1.2.2 14胚龄尿囊膜血管的固定 孵化至13胚龄时随机选取6枚/组孵化的种蛋，在气室端开孔，缓慢滴入2 mL甲醇-丙酮(1∶1)混合固定液，固定1 h后，将尿囊膜与壳膜一起剪下，贴在载玻片上，等待风干，在显微镜下拍照分析。采用Image-Pro Plus 6.0分析软件对显微镜下拍照的图像进行处理并分析，以一定区域内血管面积与尿囊膜面积的比值及小血管(直径<50 μm)数目作为最终参考数据。

1.2.3 14胚龄采集尿囊膜 孵化至14胚龄时随机选取10枚/组孵化的种蛋，采集完整的尿囊膜称质量并分装至标记好的EP管内，液氮下速冻，随后转入-80 ℃冰箱保存。

1.2.4 1日龄雏鸡生长性能和抗氧化性能的测定 其他种蛋继续孵化至出雏，待全部孵出后称量出雏质量，然后颈部采血，再采集脑组织、肝脏、胸肌、腿肌、小肠并分别称质量；分装至1.5 mL离心管中并尽快放入液氮速冻，随后再转入-80 ℃冰箱保存。血清和肝脏组织的SOD酶活性、GSH-Px酶活性及MDA含量使用南京建成生物工程研究所试剂盒测定。

1.2.5 基因表达量的测定 提取鸡胚绒毛尿囊膜和肝脏的总RNA，并进行总RNA质量鉴定，经鉴定RNA质量完整、无降解和污染后，再进行 cDNA的合成和质量检测，最后实时荧光定量PCR分别检测绒毛尿囊膜上、mRNA的相对表达量和肝脏、mRNA的相对表达量。以-作为内参，PCR引物序列见表1。

表1 PCR引物序列

1.3 数据处理

2 试验结果

2.1 银耳多糖浸泡种蛋对鸡胚血管生成的影响

2.1.1 13胚龄肉鸡 由表2可知，与对照组相比，银耳多糖低、高浓度组的血管面积/尿囊膜面积的值均显著高于对照组(<0.05)，高浓度组与低浓度组相比显著增加(<0.05)；低、高浓度组的小血管数目和对照组相比均显著增加，且高浓度组显著高于低浓度组(<0.05)。

表2 银耳多糖浸泡种蛋对13胚龄鸡胚尿囊膜血管生成的影响

2.1.2 14胚龄肉鸡 由表3可知，高浓度组的鸡胚尿囊膜mRNA的相对表达量与对照组相比显著上调(<0.05)，而低浓度组与对照组相比差异不显著(>0.05)。不同浓度银耳多糖溶液浸泡种蛋对14胚龄肉鸡尿囊膜上mRNA的相对表达量均无显著影响(>0.05)。

表3 银耳多糖浸泡种蛋对14胚龄绒毛尿囊膜VEGF和FGF2基因表达的影响

2.2 银耳多糖浸泡种蛋对胚蛋比和器官指数的影响

由表4可知，低浓度组肝脏指数与对照组相比有增加的趋势(0.05<<0.1)，而其余器官指数和高浓度组的所有器官指数与对照组相比差异均不显著(>0.05)。

表4 银耳多糖浸泡种蛋对出雏肉鸡器官指数的影响

2.3 银耳多糖浸泡种蛋对雏鸡抗氧化性能的影响

由表5可知，高、低浓度组血清中的MDA含量均显著低于对照组(<0.05)；与对照组相比，高浓度组血清中的SOD活性有增强的趋势(0.05<<0.1)，但低浓度组血清中SOD活性并无显著变化(>0.05)；低、高浓度银耳多糖组血清中的GSH-Px活性与对照组相比均无显著差异(>0.05)。

表5 银耳多糖浸泡种蛋对出雏肉鸡血清SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影响

由表6可知，与对照组相比，低浓度组和高浓度组肝脏GSH-Px、SOD活性均无显著差异(>0.05)。与对照组相比，低浓度组肝脏MDA含量显著降低(<0.05)，高浓度组MDA含量有降低的趋势。

表6 银耳多糖浸泡种蛋对出雏肉鸡肝脏SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影响

2.4 银耳多糖浸泡种蛋对雏鸡肝脏IGF-1、GHR mRNA相对表达量的影响

由表7可知，银耳多糖高浓度组与对照组和低浓度组相比，mRNA相对表达量显著上调(<0.05)，低浓度组基因表达与对照组相比没有显著差异(>0.05)。与对照组相比，银耳多糖高浓度组mRNA的相对表达量有上调的趋势(0.05<<0.1)，而低浓度组无显著变化(>0.05)。

表7 银耳多糖浸泡种蛋对出雏肉鸡肝脏GHR和IGF-1基因表达的影响

3 讨论

3.1 银耳多糖浸泡种蛋对鸡胚血管生成的影响

大量研究表明，在胚胎早期给予外源性营养物质能促进胚胎的生长发育，并且能够对家禽产生短期或长期潜在的影响。在鸡胚发育过程中，绒毛尿囊膜上丰富的血管是鸡胚与外界气体交换的通道。鸡胚通过尿囊膜上密集的血管网也可获得所需的营养物质，其经过血管运送至胚胎各部位加以利用，并排出机体代谢产生CO。相关研究表明，血管生成面积/尿囊膜面积(VA/CAM)的值比较客观、准确、快速地定量鸡胚尿囊膜的血管生成情况。在本试验中，和对照组相比，20、40 mg/L银耳多糖溶液浸泡种蛋均显著增加了绒毛尿囊膜上血管面积和小血管数量，而且随着银耳多糖溶液浓度的增加，其血管生成的效果更加显著。血管生成数量与血管生成面积呈正相关，血管面积随血管数目的变化而变化。研究发现，麦冬多糖处理鸡胚，显著提高了绒毛尿囊膜上血管数量。试验研究结果和以上研究结果大体一致，但也有不一致之处，如红花多糖处理鸡胚绒毛尿囊膜可以通过抑制肿瘤血管的生成，缩小血管的横截面积，说明植物多糖影响血管生成的原因可能与多糖种类有关。

血管的生成受多种血管生成因子调控，包括碱性成纤维细胞生长因子FGF2及血管内皮细胞生长因子VEGF。VEGF与胚胎血管的形成是分不开的，一些因素通过影响VEGF的活性或表达，进而影响胚胎期尿囊膜上血管的生成。为探明银耳多糖溶液促进鸡胚血管生成的作用机制，试验测定了尿囊膜上血管生成相关的因子VEGF和FGF2的相对表达量。结果发现，高浓度组绒毛尿囊膜上的相对表达量显著上调，低浓度组基因的相对表达量较对照组相比虽有一定程度的上调，但差异不显著，蛋白水平是否有差异有待进一步研究；而低、高浓度的银耳多糖对鸡胚尿囊膜上mRNA的表达均无显著影响。研究发现，基因的相对表达量与血管密度呈正相关。研究表明，在培养人静脉内皮细胞中给予不同剂量的瘦素，能促进细胞增殖，显著上调细胞基因表达，但基因的相对表达量无显著变化。也有研究发现，蛋内注射地塞米松对鸡胚绒毛尿囊膜上的表达量无显著影响。所以，银耳多糖对鸡胚的尿囊膜上血管的作用机制可能是通过上调绒毛尿囊膜上基因的表达，从而促进血管生成，而的相对表达量对血管生成的作用有待进一步研究。

3.2 银耳多糖浸泡种蛋对雏鸡抗氧化性能和生长性能的影响

机体在代谢过程中会产生大量的自由基，其与细胞膜上的不饱和脂肪酸反应，均能损害细胞膜结构，进而影响细胞膜的生物学功能。植物多糖能提高机体的抗氧化功能，它是通过清除机体内产生的多余自由基来抑制细胞内氧化应激，从而减少细胞损伤。在本试验中，银耳多糖溶液浸泡种蛋对出雏肉鸡体质量、小肠、胸肌、肝脏、脑指数的影响均不显著。银耳多糖溶液浸泡种蛋后，高、低浓度组的出雏肉鸡血清MDA含量显著低于对照组，低浓度组肝脏MDA含量和对照组相比显著降低。这说明添加银耳多糖后雏鸡氧化产物减少，抗氧化性能增强，虽然出雏鸡的血清和肝脏的GSH-Px和SOD活性较对照组相比差异均不显著，但高浓度组血清SOD活性较对照组有增强的趋势，其他抗氧化指标有无影响有待进一步研究。研究表明，20 mg/L黄芪多糖溶液浸泡种蛋可显著提高出雏鸡的肝脏和免疫器官的抗氧化性能。也有研究发现，给-半乳糖致衰老模型小鼠持续灌胃8周银耳多糖溶液100、200、400 mg/kg(bw)，小鼠血清、肝脏和脑组织GSH-Px活性、SOD活性和总抗氧化能力均显著增强。而相关的体外研究也表明，多糖的体外研究试验以维生素C为对照，比较枸杞多糖、白术多糖、当归多糖对鸡胚肝细胞的抗氧化能力的影响。结果发现，3种多糖均能抑制过氧化氢引起的鸡胚肝细胞活力的降低、细胞内ROS含量升高，提高抗氧化酶活性，从而增强鸡胚肝细胞的抗氧化能力。除此之外，蛋内注射500 μL白霉素、抗坏血酸、槲皮素，对肉仔鸡的孵化率、早期生长性能和肝脏抗氧化性能均无显著影响。所以，给予胚胎外源营养素对雏鸡的抗氧化性能影响结果的差异可能和鸡的品种、不同的营养素及添加量有关。本试验银耳多糖溶液浸泡种蛋可通过提高血清SOD活性和降低MDA含量，进而提高出雏肉鸡的抗氧化性能。

银耳多糖是一种酸性杂多糖。基础饲粮中添加戊聚糖可促进肉鸡体质量和器官发育，说明戊聚糖可能作为生理增强剂促进肉鸡生长。本试验结果表明，银耳多糖浸泡种蛋对雏鸡的小肠、肝脏、脑、胸肌等器官指数没有显著影响。但与对照组相比，低浓度组肝脏指数有增加的趋势。家禽的生长发育受神经内分泌生长轴调控，主要依赖“下丘脑-垂体-靶器官”。其过程为：下丘脑调控生长激素，通过垂体分泌释放，经血液循环到达肝脏，与肝细胞膜表面的生长激素受体特异性结合，启动信号转导机制，从而促进IGFs基因的表达。肝脏是生长激素最重要的靶器官，也是表达量最高的器官。胰岛素样生长因子1(IGF-1)属于胰岛素样生长因子家族成员，主要产生于肝细胞，也调控家禽生长发育和细胞生长。产生的IGF-1可以促进肌肉的生长发育，加快蛋白质合成。本试验结果显示，高浓度银耳多糖浸泡种蛋，显著提高了肝脏mRNA的相对表达量；同时，高浓度组肝脏mRNA表达量与对照组相比有增加趋势。体外研究也表明，IGF-1促进卫星细胞的增殖。IGFs系统包括IGF-1、IGF-2等其他因子，肝脏GH通过与肝上的GHR结合诱导产生IGFs，进而调节机体的生长发育。本试验中银耳多糖多胚蛋比及各器官指数均无显著影响，但高浓度银耳多糖浸泡种蛋上调了与生长轴上相关基因的表达，对出雏后肉鸡的生长发育有无影响仍有待进一步研究。

4 结论

高、低浓度组银耳多糖溶液浸泡种蛋均能促进肉鸡鸡胚尿囊膜上血管生成，提高雏鸡的抗氧化性能和生长性能，其中，40 mg/L银耳多糖浸泡种蛋效果较好，但银耳多糖溶液浸泡种蛋能否促进出雏后肉鸡的生长发育等问题还有待进一步探究。