丹参素异丙酯对D-半乳糖致衰老大鼠肾脏的保护作用

施 念，王志红，王世祥，郑晓晖，谢滢滢，程亮星，赵松峰

1)郑州大学第一附属医院物理诊断科 郑州 450052 2)郑州大学第二附属医院妇科 郑州 450014 3)西北大学生命科学学院 西安 710069 4)郑州大学第一附属医院《肿瘤基础与临床》编辑部 郑州 450052 5)郑州大学第一附属医院药学部 郑州 450052

衰老是指生物体随年龄增加，机体多种器官发生退行性变、功能减退，进而死亡的一种不可逆的自然现象。衰老的自由基学说和线粒体学说认为，氧自由基造成的损伤是细胞衰老的主要原因之一[1]。丹参素异丙酯[isopropyl-3-(3,4-dihydro-xyphenyl)-2-hydroxypropanoate，IDHP]是采用代谢组学分析复方丹参方药物成分时发现的一种代谢物。既往研究[2-3]证实，IDHP具有舒张血管、延缓脑衰老、对抗心肌缺血再灌注损伤等作用，但是否对衰老大鼠肾脏组织具有抗氧化作用尚不清楚。本实验观察了D-半乳糖(D-galactose，D-gal)致衰老大鼠肾脏组织的形态学和功能性变化，并通过观察IDHP干预对衰老大鼠肾脏组织超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、过氧化氢酶(catalase，CAT)活性及丙二醛(malondialdehyde，MDA)、过氧化脂质(lipid peroxides，LPO)水平的影响，探讨IDHP的抗氧化作用机制，以期为IDHP在抗衰老中的后续研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物及试剂6个月龄健康Wistar大鼠40只[动物合格证号：SCXK(豫)2005-0001]由河南省实验动物中心提供，雄雌各半，雄性体重310～340 g，雌性体重230～250 g。IDHP(批号：2006-2)由西安交通大学-西北大学中草药现代化研究及工程中心馈赠；D-gal购自美国Amresco公司；维生素E(vitamin E，VE)注射剂购自上海通用药业股份有限公司；考马斯亮蓝试剂盒及SOD、GSH-Px、CAT、MDA、LPO检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2 动物分组及给药方法40只Wistar大鼠按性别采用随机数字表法均分为空白对照组、衰老模型组、VE(100.0 mg/kg)组、高剂量IDHP(21.0 mg/kg)组和低剂量IDHP(7.0 mg/kg)组5组，每组8只。空白对照组：皮下注射8.5 g/L氯化钠溶液4 mL/(kg·d)；衰老模型组：分别皮下注射25 g/L D-gal溶液2 mL/(kg·d)、8.5 g/L氯化钠溶液2 mL/(kg·d)；VE组、高剂量IDHP组和低剂量IDHP组：分别皮下注射25 g/L D-gal溶液2 mL/(kg·d)、相应浓度的药物2 mL/(kg·d)，即50.0 g/L VE溶液、10.5 g/L IDHP溶液、3.5 g/L IDHP溶液。连续注射8周。

1.3 标本采集各组大鼠在末次给药1 h后，称体重，腹腔注射10 g/L戊巴比妥钠4.0 mL/kg进行麻醉，经下腔静脉采血，然后取出双侧肾脏并称取总质量。

1.4 肾脏指数计算参考文献[4]，根据大鼠体重和双侧肾脏总质量，计算肾脏指数：肾脏指数=肾脏质量(g)/大鼠体重(kg)。

1.5 血清肌酐、尿素水平检测采集的静脉血常温条件下4 000 r/min离心10 min后，取上清液，采用7020型全自动生化分析仪(日本Hitachi公司)检测血清肌酐、尿素水平。

1.6 肾脏组织细胞形态观察左侧肾脏经40 g/L多聚甲醛固定24 h，常规方法制成石蜡块，切片，厚度4 μm，进行HE染色，光学显微镜下观察。

1.7 肾脏组织氧化损伤指标检测右侧肾脏用4 ℃预冷8.5 g/L氯化钠溶液冲洗，滤纸吸干，用8.5 g/L氯化钠溶液制成组织匀浆，4 ℃、4 000 r/min离心15 min，取上清液，测SOD、GSH-Px、CAT、MDA、LPO。SOD用黄嘌呤氧化酶法，GSH-Px用5,5-双硫代对硝基苯甲酸显色法，CAT用钼酸铵法，MDA和LPO用硫代戊巴比妥法，总蛋白定量用考马斯亮蓝法。所有操作均按照试剂盒说明书进行。

1.8 统计学处理采用SPSS 17.0处理数据。各组肾脏指数，血清肌酐、尿素水平，肾脏组织SOD、GSH-Px、CAT活性及MDA、LPO水平的比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 各组大鼠肾脏指数比较与空白对照组相比，衰老模型组大鼠肾脏指数降低；与衰老模型组相比，VE组、高剂量IDHP组和低剂量IDHP组大鼠肾脏指数升高；与低剂量IDHP组相比，VE组、高剂量IDHP组大鼠肾脏指数升高。见表1。

2.2 各组大鼠血清肌酐、尿素水平比较与空白对照组相比，衰老模型组大鼠血清肌酐、尿素水平升高；与衰老模型组相比，VE组、高剂量IDHP组和低剂量IDHP组大鼠血清肌酐、尿素水平降低；与低剂量IDHP组相比，VE组、高剂量IDHP组大鼠血清肌酐、尿素水平降低。见表1。

表1 各组大鼠肾脏指数和血清肌酐、尿素水平比较(n=8)

2.3 各组大鼠肾脏组织细胞形态变化空白对照组大鼠肾脏组织无明显病理改变，肾小球密集分布，结构完整清晰，多呈圆形或椭圆形，肾小球囊囊腔、肾小管管腔规则且无明显扩张，间质无炎性细胞浸润和纤维化。衰老模型组肾小球数量明显减少，分布稀疏，球体缩小且形状不规则，肾小球囊囊腔、肾小管管腔明显扩张并可见少量肾小管坏死，间质可见炎性细胞浸润和少量纤维化。VE组、高剂量IDHP组镜下表现接近空白对照组，仅可见少量肾小管管腔扩张。低剂量IDHP组相对于衰老模型组有明显改善，肾小球数量增多，形态趋于正常，但肾小球囊囊腔、肾小管管腔扩张仍然存在，改善程度不及VE组、高剂量IDHP组。见图1。

A：空白对照组；B：衰老模型组；C：VE组；D：高剂量IDHP组；E：低剂量IDHP组

2.4 各组大鼠肾脏组织氧化损伤指标比较与空白对照组相比，衰老模型组大鼠肾脏组织SOD、GSH-Px、CAT活性降低，而MDA、LPO水平升高；与衰老模型组相比，VE组、高剂量IDHP组和低剂量IDHP组大鼠肾脏组织中SOD、GSH-Px、CAT活性升高，而MDA、LPO水平降低；与低剂量IDHP组相比，VE组、高剂量IDHP组大鼠肾脏组织中SOD、GSH-Px、CAT活性升高，而MDA、LPO水平降低。见表2。

表2 各组大鼠肾脏组织中SOD、GSH-Px、CAT活性及MDA、LPO水平比较(n=8)

3 讨论

自由基学说、线粒体学说等[4-6]认为，自由基主要产生于线粒体的呼吸链，并可由机体中的酶类或抗氧化剂清除。自由基参与多种氧化反应，造成生物大分子结构改变、功能丧失，从而加快了衰老的进程。肾脏是机体衰老过程中组织损伤的典型靶器官，对氧化损伤高度敏感，结构改变和功能衰退进展很快[7]。D-gal可在醛糖还原酶催化下还原成不被机体代谢的半乳糖醇，因而一定时间内连续注射D-gal会导致细胞内半乳糖醇过量，通过影响细胞内正常渗透压，导致细胞自身肿胀及细胞器功能异常、代谢功能异常等，最终导致机体出现退行性变化。因此，利用D-gal可以制作大鼠衰老模型，且其组织器官的器质性变化和功能改变以及可客观测量指标变化等均与自然衰老大鼠相近[8]。

肾脏指数是反映肾脏衰老程度的重要指标，而肾脏组织细胞形态变化和血清肌酐、尿素水平可以评估肾脏衰老相关的功能性和器质性损伤[4，9]。SOD、GSH-Px、CAT均为抗氧化酶类，正常情况下主要发挥保护细胞膜和线粒体膜等生物膜完整性的作用。SOD是体内唯一以超氧阴离子为底物的酶，对氧自由基的清除起着至关重要的作用；GSH-Px是一种重要的过氧化物分解酶；CAT则是催化过氧化氢分解成氧和水的酶。上述3种酶类均可以通过发挥抗氧化作用减轻机体过氧化造成的损伤，其水平在一定程度上反映了机体抗氧化能力，由于机体衰老过程中伴随抗氧化能力不断下降，其还可以间接反映机体衰老程度[10-11]。MDA是氧自由基作用下生物膜中的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应的产物。机体MDA水平可以直接用于脂质过氧化反应程度评估，也可以间接反映体内氧由基水平[12]。LPO是一种自由基或活性氧作用于不饱和脂肪酸链后产生的含有过氧基的脂质，已被证实可以准确反映机体的脂质过氧化程度[13]。衰老过程中已经被证实存在较严重的脂质过氧化情况，因此MDA、LPO均可以反映机体的脂质过氧化程度，间接反映机体衰老程度。

复方丹参方具有抗心肌缺血、抗动脉粥样硬化的作用，具体作用机制尚未完全阐明。IDHP作为复方丹参方中的主药丹参的人体代谢物，在前期基础研究[2-3]中已经被证实具有舒张血管、延缓脑衰老、对抗心肌缺血再灌注损伤等作用，且可能与其抗氧化、抑制炎症反应、促进血管生成等有关。本研究通过比较衰老模型组和空白对照组大鼠氧化损伤指标和肾脏指数等发现D-gal能够导致机体过氧化损伤，能够成功制作衰老模型，还经过比较发现其他各治疗组对这些指标显示出明显的改善效应，且IDHP的抗氧化作用可能具有一定的剂量依赖性，并且一定量的IDHP可以达到和VE相近的作用，这进一步证实了IDHP延缓机体衰老的作用，并探析了其可能的机制。

综上所述，IDHP用于D-gal致衰老大鼠，可以延缓其肾脏衰老，其机制可能与IDHP的抗氧化作用有关。

致谢:感谢郑州大学付润芳、苑帅、周斐、曾宏玲、陈淼、仵菲斐在实验操作中的帮助。