甘草查尔酮A减轻顺铂诱导的人肾小管上皮细胞HK-2损伤的实验研究

王欣瑜，彭 力

顺铂具有抗肿瘤谱广、抗癌活性高、疗效可靠、价格低廉的优点，作为一线治疗方案广泛用于实体瘤的治疗[1]。尽管采用了水化疗法，但严重的毒副作用仍极大影响了癌症患者的治疗和生存[2]。肾毒性是顺铂临床主要限制性毒性，尚缺乏有效防护手段。因此，治疗和预防顺铂肾毒性是临床化疗过程中亟待解决的重要问题。顺铂在肾脏内长时间的蓄积会抑制活性氧簇(ROS)的还原清除或增加活性氧的产生，使细胞中ROS水平升高，启动机体氧化应激过程，导致组织器官的损伤[2-3]。近年来，许多中药有效成分可以通过参与调节不同环节抑制活性氧的产生发挥抗氧化作用[4]。甘草作为宁夏的道地中药材，其有效成分甘草査尔酮A(Lico A)表现出抗炎、抗氧化等生物活性，在临床上具有广泛的应用前景[5]。研究表明，甘草查尔酮A具有强大的抗氧化能力，可增加抗氧化酶表达，减少氧化应激[6]，对缺血缺氧性脑病的神经细胞具有保护作用[7]，对CCl4所致损伤的大鼠肝脏的保护作用也得到证实[8]。但甘草查尔酮A是否能减轻顺铂所致肾小管上皮细胞的损伤，尚无文献报道。本文采用人肾近端小管上皮细胞株HK-2，评价甘草查尔酮A对顺铂致伤的HK-2细胞的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料：顺铂(Pt含量65%，批号B12J10L79601)、甘草查尔酮A(纯度≥96%，批号C15A10M94486)购于上海源叶生物科技有限公司;青链霉素混合液、DMEM-F12培养基和胰蛋白酶购于Gibco / Thermo Fisher Scientific公司(美国)；胎牛血清购于上海吉泰生物科技公司；细胞培养耗材购于Costar公司(美国)；CCK-8试剂盒、凋亡试剂盒和DEPC水购于江苏碧云天生物技术公司；Total RNA提取试剂(RNAiso Plus)购于宝生物工程(大连)有限公司；HiScript III RT SuperMix for PCR 购于南京诺唯赞生物科技股份有限公司；iTaq Universal SYBR Green Supermix 购于Bio-Rad公司(美国)；PCR 反应引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成；其余试剂均为市售。

1.2 主要仪器：细胞培养箱(Thermo Fisher，美国)，Synergy H1全功能酶标仪(Bio-Tek Instruments，美国)，CFX96 Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad，美国)，BD Accuri C6流式细胞仪(BD biosciences,美国)，Thermo 1300 系列A2型生物安全柜(Thermo Scientific，美国)。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养：人肾小管上皮细胞HK-2购自中乔新舟生物科技有限公司。使用10%胎牛血清(FBS)和100 IU/mL青链霉素的DMEM-F12(1∶1)培养基于37 ℃，含5% CO2，在相对湿度90%的培养箱中培养，当密度达到90%后进行传代，取3～10代的细胞用于实验。

1.3.2 细胞给药和分组：HK-2细胞点板24 h后，分为4组给药，分别为对照组、顺铂组、合用组(顺铂+甘草查尔酮A)、甘草查尔酮A组。对照组给予不含药的培养基，与其他组平行操作；顺铂组给予顺铂20 μM；合用组同时给予顺铂20 μM和LicoA 4 μM；甘草查尔酮A组给予LicoA 4 μM；孵育12或24 h，进行后续实验。

1.3.3 细胞增殖试验：将HK-2细胞按1×104个细胞/孔的密度在96孔板中铺板，按上述分组给药孵育。培养24 h后，吸去上清,每孔加入100 μL稀释好的1×CCK8溶液于37 ℃培养4 h后，酶标仪上450 nm波长下测定OD值。细胞活力(%)=(OD药物-OD空白)/(OD对照-OD空白)×100%，使用graphpadprism 8计算IC50。顺铂浓度设定分别为2、5、10、20、40、80、100 μM。Lico A的浓度为4 μM，该浓度对HK-2细胞活力没有抑制，且药效明显。

1.3.4 细胞凋亡检测：在6孔板中以2×105个细胞/孔的密度铺板，按上述分组给药孵育。培养24 h后，按照Annexin V-FITC试剂盒说明书进行样品处理，每个样品分别添加195 μL结合液、5 μL Annexin V-FITC和10 μL碘化丙啶染色液，室温避光孵育20 min，随后置于冰浴中，上流式细胞仪机检测。凋亡率=早期凋亡率(右下象限百分比)+晚期凋亡率(右上象限百分比)。

1.3.5 荧光定量PCR检测：在12孔板中以1×105个细胞/孔的密度铺板，按上述分组给药孵育。培养12 h后，提取总RNA，cDNA合成试剂盒合成cDNA，qRT-PCR检测细胞中caspase-3、caspase-8、caspase-9，β-actin mRNA水平。反应过程:95 ℃预变性反应 90 sec，PCR 循环反应(包括 95 ℃ 30 sec、退火温度 30 sec、72 ℃ 30 sec)进行40个循环;0.5 ℃/5 sec 从 65 ℃升温至 95 ℃，进行溶解曲线分析。采用Livak法计算mRNA水平。

2 结果

2.1 甘草查尔酮A对顺铂致HK-2细胞增殖抑制的影响：随着顺铂浓度的增大，细胞增殖被抑制的情况越来越严重。顺铂在HK-2细胞上24 h的IC50为28.52 μM，见图1至图2(目录后)。从图2可知，与对照组比较，甘草查尔酮A组HK-2细胞活力无变化(P> 0.05)，顺铂组细胞活力显著下降(P<0.05)；与顺铂组比较，合用组的细胞活力由(40.52±5.65)%上升到(69.42±5.54)%(P<0.05)，表明甘草查尔酮A可以显著改善由顺铂诱导的HK-2细胞的生长抑制。

2.2 甘草查尔酮A对顺铂致HK-2细胞凋亡的影响：Annexin V-FITC和碘化丙啶染色，与对照组相比，顺铂组凋亡细胞比例由(5.71±1.20)%上升到(20.33±1.81)%。合用甘草查尔酮后，合用组凋亡率下降至(7.77±1.98)%，与顺铂组比较差异有统计学意义(P< 0.05)，说明合用甘草查尔酮可以显著逆转顺铂诱导的HK-2细胞凋亡。

2.3 甘草查尔酮A对顺铂致HK-2细胞凋亡相关基因表达量的影响：与对照组比较，顺铂组caspase-3、caspase-8和caspase-9的mRNA水平显著增高(P<0.05)；与顺铂组比较，甘草查尔酮A+顺铂合用组的caspase-3、caspase-8和caspase-9的mRNA表达均出现了显著性下降(P< 0.05)，见图3(目录后)。

3 讨论

肾近端小管是顺铂肾毒性损伤的主要部位[2]。由于体内环境复杂，动物实验很难确定肾损伤的确切机制，因此体外培养模型逐渐应用于药物肾毒性的评价、优化筛选及机制研究中。HK-2细胞是成人肾近端小管上皮细胞，可永生化传代，功能更接近原代培养细胞，已成为研究各种药物肾毒性及肾小管损伤机制的重要细胞模型[9]。近年来有越来越多的中药被证明可以预防或治疗顺铂急性肾损伤[10-13]。甘草查尔酮A是甘草的主要活性成分之一，有较为广泛的药理活性，包括抗菌、抗肿瘤、抗炎、抗寄生虫等[5,14]。本研究中，甘草查尔酮A显著降低了顺铂造成的HK-2细胞增殖抑制，说明其具有一定的保护作用。

顺铂肾毒性的主要机制包括DNA损伤、内质网应激和线粒体功能障碍、凋亡、氧化应激和炎症等[2]。其中，凋亡是肾小管细胞的主要死亡方式之一。本研究表明，甘草查尔酮A显著降低了顺铂造成的HK-2细胞凋亡。文献报道[2,3,15]，顺铂不仅能调控线粒体依赖凋亡途径(又称内在途径)，也能启动死亡受体介导的外源性凋亡，引起肾毒性。内在途径由细胞应激(例如 DNA 损伤)启动，通过调控的p53、Bcl-2、Bax等线粒体凋亡信号分子的表达，使线粒体膜通透性增加，导致细胞色素C从线粒体释放，通过与凋亡促进激活因子-1 (APAF-1) 的相互作用，从而激活caspase-9，并进一步激活效应子caspase-3、caspase-6及caspase-7等引起细胞凋亡。外源性细胞凋亡途径是指也可以通过调控细胞膜上的肿瘤坏死因子受体(TNFR1)，上调Fas / Fas-L系统表达，并激活caspase-8，通过直接激活caspase-3或裂解BID为更短的tBID诱导Bak形成寡聚体激活细胞凋亡。本研究中甘草查尔酮A显著降低了顺铂诱导的caspase-3、caspase-8、caspase-9的mRNA水平的升高，提示甘草查尔酮A不仅能通过线粒体依赖的内在凋亡途径，还通通过死亡受体依赖的外在凋亡途径缓解顺铂对HK-2细胞的损伤。研究发现，顺铂引发的肾小管细胞凋亡与细胞氧化应激、亚硝化应激有关[2-4]。甘草查尔酮A是否通过氧化应激发挥保护作用值得进一步研究。

总之，本研究以HK-2细胞为体外模型，证明了甘草查尔酮A可以减轻顺铂所造成的人肾小管上皮细胞HK-2的生长抑制、凋亡增多，同时也发现甘草查尔酮A对顺铂参与的内在和外在凋亡途径都有调控作用，说明甘草查尔酮A对顺铂致伤的HK-2细胞有一定保护作用，为顺铂的治疗提供了新的策略。