超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法快速测定3 种含生物碱类中药材中193 种农药残留

曹依敏, 周 恒, 兰 岚, 苗 水, 胡 青,毛秀红, 张红梅, 季 申*,

(1. 上海中医药大学 中药学院，上海 201203；2. 上海市食品药品检验研究院，上海 201203)

生物碱 (alkaloid) 是指主要来源于植物界的一类含氮有机化合物，多呈碱性，具有显著的抗肿瘤、抗菌消炎等生物活性，是中药材中重要的有效成分之一[1]。延胡索 Rhizoma Corydalis，又称元胡，是罂粟科植物延胡索Corydalis yanhusuoW.T. Wang 的干燥块茎[2]。黄连 Rhizoma Coptidis，是毛茛科植物黄连Coptis chinensisFranch.、三角叶黄连Coptis deltoideaC. Y. Cheng et Hsiao 或云连Coptis teetaWall. 的干燥根茎[2]。黄柏Cortex Phellodendri，是芸香科植物黄皮树Phellodendron chinenseSchneid.的干燥树皮[2]。这3 种中药材作为典型含生物碱类中药材在临床广泛使用，近几年对其需求量迅速增长，规模化人工种植已成为其主要获取方式。在种植过程中发生病虫害，需要使用农药进行防治，但超剂量、超范围使用农药的现象较为普遍，给中药材农药残留安全防控带来严峻挑战[3-4]。因此，有必要建立适用于含生物碱类中药材的农药多残留快速筛查方法，以保证其用药安全。

目前中药材中农药残留检测方法主要有气相色谱法、液相色谱法、气相色谱-串联质谱法以及液相色谱-串联质谱法等[5-8]，其中串联质谱技术由于灵敏度高、选择性好，在中药材农药残留检测中应用范围较为广泛[9-11]。三重四极杆串联质谱一般采用多反应监测扫描模式，但受限于分辨率和扫描速率，在复杂中药样本分析中仍可能受到基质干扰成分影响，出现假阳性或假阴性结果。近几年，高分辨质谱 (HRMS) 技术快速发展，已广泛应用于蔬菜水果[12-14]、豆类杂粮[15]、辣椒粉[16]、茶叶[17]以及葡萄酒[18]等食品基质的农药残留风险监测，而将HRMS 应用于中药材中农药多残留检测分析的报道相对较少[19-22]。静电场轨道阱高分辨质谱具有高分辨率和高质量精度等特点，采用全扫描/数据依赖型二级扫描模式 (Full MS/ddMS2)，可同时获得目标物母离子和碎片离子的精确质量数等质谱信息，具有更强的抗基质干扰能力，并能实现非目标物的回溯分析，对复杂基质的农药残留高通量快速筛查具有更广阔的应用前景。

本研究针对含生物碱类中药材的基质特点，通过改良QuEChERS 前处理方法，首次引入阳离子交换型吸附剂作为分散固相萃取净化填料，以去除生物碱类等干扰物质，结合超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱 (UPLC-Q-Orbitrap HRMS) 建立了3 种含生物碱类中药材中193 种农药残留的定性定量检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器、药剂与试剂

超高效液相色谱-四极杆/静电轨道阱高分辨质谱仪：Acquity 超高效液相色谱仪 (美国Waters 公司) + Q-Exactive 高分辨质谱仪 (美国Thermo 公司)；Agilent 1260 型高效液相色谱仪 (美国Agilent公司)；KS 260 control 振荡器 (德国IKA 公司)；MINI VORTEXER 涡旋仪 (美国Fisher Scientific 公司)； MULTIVAP 113 型氮气吹干仪 (美国OI-SYS公司)； SQP/CP224S/CP225D型电子天平 (德国Sartorius 公司)。

193 种农药标准品 (德国Dr. Ehrensterfer GmbH 公司或德国Sigma-aldrich 公司)；QExactive 高分辨质谱仪正离子模式校正液 (美国Thermo 公司)；甲醇 (质谱级，德国Merck 公司)；甲酸 (质谱级，美国Fisher Scientific 公司)；甲酸铵 (质谱级，美国Sigma 公司)；乙腈、甲醇、丙酮 (色谱级，美国Fisher Scientific 公司)；冰醋酸和无水硫酸镁 (分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；提取管：6 g 无水硫酸镁与1.5 g 无水醋酸钠的混合粉末 (北京迪马科技有限公司)；净化填料：十八烷基硅烷键合硅胶 (C18) (40～60 μm)、N-丙基乙二胺 (PSA) (40～60 μm)、硅胶 (40～60 μm)(天津博纳艾杰尔科技有限公司)，Oasis MCX 混合型强阳离子交换反相吸附剂 (美国Waters 公司)；去离子水 (经Milli-Q Advantage A10 过滤，美国Millipore 公司)。

1.2 仪器分析条件

色谱条件：Agilent Poroshell 120 EC-C18色谱柱 (3.0 mm × 150 mm，2.7 μm)；洗脱程序：流动相A 为含0.1%甲酸和5 mmol/L 甲酸铵水溶液，流动相B 为含0.1%甲酸和5 mmol/L 甲酸铵的甲醇溶液。梯度洗脱程序：0～1 min，95% A；＞1～4 min，95%～40% A；＞4～8 min，40%～36% A；＞8～8.5 min，36%～32% A；＞8.5～9 min，32%～25% A；＞9～16 min，25%～5% A；＞16～20 min，5% A。流速0.4 mL/min；柱温40 ℃；进样体积5 μL。

质谱条件：电喷雾离子源正离子扫描模式(ESI+)；监测方式为 Full MS / ddMS2模式；电喷雾电压3.5 kV；毛细管温度325 ℃；S-lens RF level：55.0；鞘气48；辅助气11；吹扫气2；辅助气温度325 ℃。一级质谱参数：分辨率为70 000 FWHM，自动增益控制为3 e6，最大注入时间为200 ms，扫描范围m/z70～1 050。二级质谱参数：分辨率为17 500 FWHM，自动增益控制为1 e5，最大注入时间为60 ms，loop count 为4，隔离窗口为3.0m/z，归一化碰撞能量为20、40、60，母离子强度关联触发阈值为8.3 e4，apex trigger 时间窗为2～6 s，动态排除时间为5.0 s。

1.3 样品制备

取3 g (精确至0.01 g) 粉碎 (过三号筛) 的样品至50 mL 离心管中，加入1%的冰醋酸溶液(1%为体积分数，下同) 15 mL，涡旋、浸泡30 min。准确加入乙腈15 mL，置于振荡器上剧烈振荡10 min。加入6 g 无水硫酸镁与1.5 g 无水醋酸钠的混合粉末，立即摇散，再置于振荡器上剧烈振荡5 min。于冰浴中冷却10 min，离心 (3 900 r/min)5 min。取9 mL 上清液，置于预先装有净化填料的固相萃取净化管 (无水硫酸镁900 mg，PSA 300 mg，C18300 mg，硅胶 600 mg，MCX 150 mg)中，涡旋使充分混匀，再置于振荡器上剧烈振荡10 min，离心 (3 900 r/min) 5 min。取5 mL 上清液，在氮气吹干仪上于40 ℃水浴浓缩至约0.5 mL，用50%甲醇定容至2 mL，涡旋使混匀，高速离心(10 000 r/min) 10 min。取上清液，即为空白基质溶液，待测。

1.4 农药标准溶液的制备及标准曲线绘制

1.4.1 标准储备溶液 称取适量农药标准品，根据农药标准品的不同性质分别用乙腈、甲醇或丙酮配制成1 000 mg/L 的单一标准储备溶液，于-20 ℃保存。

1.4.2 混合标准溶液 分别吸取一定体积的各单一标准储备溶液于100 mL 容量瓶中，用乙腈定容，得到1 000 μg/L 的混合标准溶液，于4 ℃保存。

1.4.3 标准工作溶液 分别量取5、10、50、100 及200 μL 的1 000 μg/L 混合标准溶液，先分别用乙腈补足体积至500 μL 后，再用50%甲醇定容至2 mL，配制成质量浓度分别为2.5、5、25、50 及100 μg/L 的标准工作溶液。按1.2 节的条件测定，以各化合物的质量浓度为横坐标 (x)，峰面积为纵坐标 (y)，权重为1/x，绘制溶剂标准曲线。

1.4.4 基质匹配混合标准工作溶液 按1.3 节的方法制备空白基质溶液，氮吹至0.3 mL 以下，分别加入5、10、50、100 及200 μL 的混合标准溶液，先用乙腈补足体积至500 μL 后，再用50%甲醇定容至2 mL，于10 000 r/min 下离心10 min，取上清液，即得质量浓度分别为2.5、5、25、50 及100 μg/L的基质匹配混合标准工作溶液。按1.2 节的条件测定，以各化合物的质量浓度为横坐标 (x)，峰面积为纵坐标 (y)，权重为1/x，绘制基质匹配标准曲线。

1.5 添加回收试验

向延胡索、黄连和黄柏空白基质溶液中分别添加193 种农药混合标准溶液，添加水平分别为10、50 和100 μg/kg，每个水平6 次重复，按1.2 节的条件测定，计算平均回收率及相对标准偏差 (RSD)。参考欧盟农药残留指导原则SANTE/12682/2019 进行评价，将实际最低添加水平作为定量限 (LOQ)[23]。

1.6 基质效应

基质效应 (Me) 作为质谱定量分析中影响方法正确度、精密度和灵敏度的主要问题之一[24]，本研究通过比较各农药化合物基质匹配标准曲线与溶剂标准曲线的斜率比评价Me，计算公式为：Me/%=[(基质匹配标准曲线的斜率/溶剂标准曲线的斜率)-1] × 100，Me＞20% 为基质增强效应，－20%≤Me≤20% 为基质效应不明显，Me＜－20%为基质抑制效应[25]。

1.7 数据处理

使用TraceFinder 4.1 数据处理软件 (美国Thermo 公司) 对原始采集数据进行处理，并配合Excel 2019 进行数据汇总和分析。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的选择

本研究采用Full MS/ddMS2扫描模式，一级质谱全扫描，同时设定目标物列表，采用自动触发二级质谱模式，获得各农药化合物的母离子及碎片离子的精确质量数和保留时间等质谱信息。农药标准品溶液按1.2 节的条件测定，建立了193 种农药的标准数据库 (表1)。为了保证母离子及碎片离子的准确度，母离子选择各农药化合物响应强度最高的母离子加合形式，一般为[M + H]+或[M + NH4]+，而对于乙酰甲胺磷等容易发生源内裂解的农药化合物，选择响应强度高的源内裂解离子作为母离子。碎片离子优先选择响应强度高、质量数大于90 的离子，同时采用Mass Frontier 4.1 软件或人工推导得到碎片离子的理论精确质量数，以避免实测值带来的二次质量偏差。

表1 193 种农药高分辨质谱标准数据库及定量限Table 1 The In-House compound database and LOQs of 193 pesticides

为提高筛查效率，降低假阳性率，保证筛查结果的准确性，农药残留的确证参数参考欧盟农药残留指导原则SANTE/12682/2019，阳性结果必须满足以下条件：与标准数据库中目标化合物的母离子及碎片离子的精确质量数偏差 ≤5 ppm (若m/z＜ 200，则精确质量数偏差 ＜1 mDa)，至少检出1 个碎片离子，保留时间窗口为 ± 0.15 min[23]。

续表1Table 1 (Continued)

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2.2 样品前处理条件的优化

2.2.1 分散固相萃取 (d-SPE) 净化填料的优化 生物碱类中药材中含有大量生物碱、甾体类、有机酸以及糖类等干扰成分。本研究考察了MCX、C18、PSA 和硅胶4 种净化填料对延胡索、黄连和黄柏的净化程度。结果 (图1) 表明：MCX 作为混合型强阳离子交换、水可浸润聚合物吸附剂，具有离子交换和反相保留双重保留模式，对碱性化合物具有较高的选择性和灵敏度，净化3 种基质中生物碱类干扰成分明显，净化效果最显著；硅胶可以去除极性较大的含氮化合物以及糖类等干扰物，净化效果次之；PSA 和C18对基质净化影响较小，但为了减少对仪器的污染，依然选择使用PSA 和C18以去除有机酸及部分弱极性干扰物。最终选择MCX、硅胶、PSA 和 C18作为净化填料。

图1 不同净化填料的净化效果 (延胡索)Fig. 1 Purification effect of different adsorbents(Rhizoma Corydalis)

固定无水硫酸镁 900 mg、PSA 300 mg 和C18300 mg，比较了硅胶用量 (300、600 和900 mg) 对净化效果的影响。结果表明：与用量300 mg 相比较，600 mg 与900 mg 的用量使得大部分农药响应明显上升，用量600 mg 与900 mg 效果相近，最终选择硅胶用量为600 mg。固定上述4 种净化填料，比较了MCX 用量 (0、90、150 和250 mg)对净化效果的影响。结果表明：MCX 加入量过多，农药会被吸附，导致回收率下降，计算所有农药的回收率 (图2)，当MCX 为150 mg 时，延胡索、黄连和黄柏中分别有98.5%、94.9% 和96.4%的农药回收率为70%～120%，符合农药残留方法学验证规定[23]。因此d-SPE 的最终配比为：无水硫酸镁900 mg，PSA 300 mg，C18300 mg，硅胶 600 mg，MCX 150 mg。

图2 不同MCX 用量下回收率在70%～120%之间的农药数量占比Fig. 2 Proportion of pesticides with recovery rate of 70%-120% under different MCX content

2.2.2 定容溶剂的优化 高通量农药残留筛查，液相色谱流动相条件初始比例一般溶剂强度较小，定容溶剂的溶剂强度如果太大，会造成峰形改变等强溶剂效应，为改善保留时间前端农药化合物的峰形，对定容溶剂进行了优化，分别比较了乙腈、V(乙腈) :V(水) =1 : 1 及V(乙腈) :V(甲醇) :V(水) =2 : 3 : 3。结果 (图3) 表明：V(乙腈) :V(甲醇) :V(水) =2 : 3 : 3 效果最佳，在该条件下3 种基质中193 种农药的提取离子流图见图4。

图3 不同定容溶剂下乙酰甲胺磷提取离子流图Fig. 3 Extracted ion chromatograms of acephate using different injection solvents

图4 3 种基质中193 种农药母离子提取离子流图Fig. 4 Extracted ion chromatogramsion of precursor ions of 193 pesticides

2.3 方法评价

2.3.1 基质效应 结果表明：193 种农药化合物中，延胡索、黄连和黄柏中分别有27.5%、99.0%和95.5%的农药显示基质抑制效应，因此采用基质匹配标准曲线进行定量分析。

2.3.2 线性关系 结果表明：除吡虫啉可能与黄连中某些碱性物质发生反应导致无响应外，其余农药化合物线性关系良好，相关系数 (r) 均大于0.99。

2.3.3 添加回收率及定量限 (LOQ) 结果表明：在10、50、100 μg/kg 3 个添加水平下，193 种农药 (包括4 组同分异构体)，在延胡索中的平均回收率为58%～120%，RSD 为0.4%～16.6%，其中190 种 (98.4%) 农药LOQ 为10 μg/kg，3 种 (1.6%)农药LOQ 为50 μg/kg；在黄连中的平均回收率为68%～124%，RSD 为0.5%～19.6%，除吡虫啉外，其中165 种 (85.5%) 农药LOQ 为10 μg/kg，22 种(11.4%) 农药LOQ 为50 μg/kg，5 种 (2.6%) 农药LOQ 为100 μg/kg；在黄柏中的平均回收率为73%～122%，RSD 为0.7%～18.9%，其中168 种(87.0%) 农药LOQ 为10 μg/kg，23 种 (11.9%) 农药LOQ 为50 μg/kg，2 种 (1.0%) 农药LOQ 为100 μg/kg。其中氯磺隆添加回收率偏低，可能是由于其水溶性较大，且在酸性条件下不稳定所致；MCX 吸附作用较强也可能导致某些农药添加回收率降低，如抗蚜威和去乙基另丁津等农药仅在基质成分相对简单的延胡索中回收率较低 (分别为58%和69%)，而在另外2 种基质中回收率在102%～108%之间。定量限详见表1。

参考《中国药典》2020 年版四部[26]中33 种禁限用农药的限量标准规定范围 (0.01～0.2 mg/kg)以及GB 2763—2021《食品中农药最大残留限量》[27]中对药用植物的最大残留限量规定范围 (0.01～20 mg/kg)，本方法建立的LOQ 值可满足3 种含生物碱类中药材中农药残留限量标准的要求。

2.4 实际样品测定

采用本方法对药材种植基地收集及药店购买的33 批延胡索、7 批黄连以及5 批黄柏样品进行测定。结果发现：农药总检出率为64.4%，共检出29 种农药，检出率较高的农药为多效唑、吡虫啉、敌敌畏、啶酰菌胺和苯醚甲环唑等。40.0%的样品同时检出2～8 种农药，其中1 批延胡索检出11 种农药，提示3 种含生物碱类中药材中存在多农药残留污染的风险。多效唑在11 批延胡索样品中被检出，检出量最高达0.11 mg/kg，参照 GB 2763—2021《食品中农药最大残留限量》[27]大豆中多效唑的限量要求 (0.05 mg/kg) 进行评判，1 批样品超过限量规定，提示延胡索存在使用植物生长延缓剂的安全风险；4 批延胡索样品检出吡虫啉，参照GB 2763—2021《食品中农药最大残留限量》[27]贝母 (干) 的限量要求 (0.2 mg/kg)，1 批样品超过限量规定；1 批黄柏和2 批黄连中检出敌敌畏，参照GB 2763—2021《食品中农药最大残留限量》[27]调味料的限量要求 (0.1 mg/kg)，1 批黄连超过限量规定；在部分样品中检出克百威、毒死蜱等高毒禁限用农药，提示亟需进一步加强中药材种植中农药的使用管理规范。表2 仅列出样品检出超过0.05 mg/kg 的测定结果。

表2 实际样品测定结果Table 2 Determination results of pesticides in real samples

3 结论

本研究建立了一种基于UPLC-Q-Orbitrap HRMS 技术对3 种含生物碱类中药材中193 种农药残留的快速筛查方法。该方法前处理简便快速、净化效果好、可操作性强，并可在较短时间内完成高通量的数据采集，检测目标农药化合物灵敏且准确度高。该方法可实现含生物碱类中药材中多农药残留的日常风险监测，也可为其他复杂中药材基质中农药残留的定性定量分析提供研究思路。