液相色谱-串联质谱法测定蔬菜和水果中的赤霉素及高效氯氰菊酯

秦安丽，章程辉，王明月，张 群

（1.中国热带农业科学院分析测试中心/海南省热带果蔬产品质量安全重点实验室，海口 571101；2.海南大学食品科学与工程学院，海口 571101）

目前，检测赤霉素（gibberellins，GA）多采用液相色谱串联质谱仪，而检测高效氯氰菊酯（β-cyperme⁃thrin）多采用气相色谱法、气相色谱串联质谱法（GC-MS，GC-MSMS）。 地 方 标 准DB12/T 986—2020［1］、中国农业行业标准NY/T 2871—2015［2］和商业标准SN/T 4257—2015［3］都采用液相串联质谱法检测赤霉素，因为赤霉素是内源性物质之一，在植物中含量很少。质谱检测灵敏度高、重复性好，尤其适合痕量植物样品的检测。高效氯氰菊酯曾被认为不适合用液相串联质谱法检测，食品安全国家标准GB/T 23200.8—2016［4］、GB/T 23200.113—2018［5］均用气相质谱法或串联质谱法检测高效氯氰菊酯，而NY/T 761—2008［6］用气相法检测氯氢菊酯，但氯氢菊酯会降解成同分异构体（顺反高效氯氢菊酯及顺反低效氯氢菊酯），真正对农业起防治作用的只有顺式高效氯氢菊酯和反式高效氯氢菊酯，用气相法也能检测出来。GB/T 20769—2008［7］收录有顺式氯氢菊酯的检测方法，但没有收录赤霉素。赤霉素和高效氯氢菊酯在农业生产中应用广泛，有关其毒理的研究多见报道，因此研究一个前处理简单、耗时短、检测线低、重现性好且能同时测定这2 种农药的方法很有必要。

本研究建立液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）同时测定蔬菜和水果中赤霉素和高效氯氰菊酯的农药残留检测方法。蔬菜、水果样品用乙腈均质提取，经过盐析分层，吸取提取液，用50%甲醇1∶1（V/V）互溶，乙腈与5 mmol/L 乙酸铵溶液进行梯度洗脱分离，采用电喷雾正负离子源模式（ESI+、ESI-）多反应监测（MRM）采集数据，外标法定量，离子比定性。

1 材料与仪器

1.1 主要试验材料与试剂

蔬菜、水果样品购于海南省海口市蔬菜水果批发市场；高效氯氰菊酯（99.1%），购于美国Cato Re⁃search Chemical Inc；赤霉素（99.0%），购于德国Dr.Ehrenstorfer Gmb H 公司；甲醇（色谱纯），购于赛默飞世尔科技有限公司Thermo Fisher Technology Co.，Ltd；乙酸（分析纯）、甲酸（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、氯化钠（分析纯），购于广州化学试剂厂；乙酸铵（分析纯），购于阿拉丁公司；N-丙基乙二胺（PSA），购于深圳逗点生物技术有限公司；石墨化炭黑（GCB），购于上海安谱实验科技股份有限公司。

1.2 主要仪器与设备

TripleQuad 4500 液相色谱三重四极杆串联质谱仪，AB SCIEX 公司；JJ500 电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；XW-80A 涡旋混合器，海门其林贝尔公司；Milli-Q A10 超纯水仪，美国Millipore 公司；GL-21M 落地式高速冷冻离心机，日本Hitachi Koki Co.，Ltd 公司。

2 试验方法

2.1 标准溶液的配置

系列基质混合标准工作溶液：采用逐级稀释法配 制 质量 浓度 分别 为0.010、0.050、0.100、0.200、0.400 mg/L 的系列基质混合标准溶液，过微孔滤膜（有机相，13 mm×0.22 μm）备用。

2.2 样品处理

2.2.1 样品制备 参考NY/T 761—2008 样品制备方法，蔬菜按四分法打成浆，葡萄打成浆，香蕉样品去皮取可食用部分，切碎打浆混匀，制成待测样品，放入样品瓶，置于-18 ℃冰箱中备用。

2.2.2 样品提取 称取10.00 g（精确至0.01 g）样品于50 mL 离心管中，加入15.0 mL 含乙腈溶液，1 500 r/min 涡旋，振荡2 min；加入5.0 g NaCl 涡旋1 min，然后以20 000 r/min-4 ℃离心5 min。

2.2.3 样品净化 吸取1.00 mL提取上层液放入2 mL容量瓶内，用50%甲醇定容至刻度，进行1∶1（V/V）稀释，过微孔滤膜（有机相，13 mm×0.22 μm），待上机检测。

2.3 仪器条件

1）超高效液相色谱条件。色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18（1.8 μm，2.1 mm×50 mm）；柱温：35 ℃；进样量：2 μL。流动相及流量见表1。

表1 流动相梯度洗脱

2）质谱条件。质谱条件见表2。

表2 质谱条件

MRM 监测离子见表3。

表3 赤霉素和高效氯氰菊酯的质谱条件参数

3 结果与分析

3.1 色谱条件优化

色 谱 柱：ZORBAX Eclipse Plus C18（1.8 μm，2.1 mm×50 mm），在流速为0.30 mL/min 条件下，乙腈-5 mmol/L 乙酸铵溶液作为洗脱液时，目标化合物离子化程度比乙腈-甲醇、乙腈-水作为洗脱液时效果好。在此测定条件下，赤霉素最长保留时间为3.19 min，高效氯氰菊酯最长保留时间为5.31 min。

3.2 不同提取剂对赤霉素和高效氯氰菊酯回收率的影响

研究比较了乙腈、0.1%甲酸乙腈、1.0%甲酸乙腈、0.1%乙酸铵乙腈、1.0%乙酸铵乙腈5 种提取剂对普通白菜、豇豆、葡萄、香蕉中赤霉素和高效氯氰菊酯的提取效果（表4）。

由表4 可知，加酸后的乙腈作提取剂时，赤霉素的回收率提高了，但高效氯氰菊酯的回收率反而降低。因为赤霉素易溶于酸性环境中，乙腈为提取剂时两者回收率均达到方法要求。基于方法简便考虑，最终选择纯乙腈作为提取剂，而且乙腈为提取剂对普通白菜、豇豆、葡萄、香蕉中赤霉素和高效氯氰菊酯在仪器上的响应和峰型都达到理想效果（图1）。高效氯氰菊酯在仪器上出现2 个峰型，是因为高效氯氰菊酯两对外消旋体混合物，其顺反比约为2∶3。

图1 赤霉素（1）和高效氯氰菊酯（2）在各个基质的加标定量离子色谱图

表4 不同提取剂对赤霉素和高效氯氰菊酯的回收率 （单位：%）

3.3 不同净化方式对赤霉素和高效氯氰菊酯回收率的影响

QuEChERS 前处理方法常用的净化剂有PSA、C18、GCB 等［8，9］，其中PSA 主要用于除去样品中的糖类、有机酸、金属离子等，C18 用以除去试样中脂类和蛋白质等成分，GCB 对样品中色素有较强的吸附净化能力［10，11］。本研究分别以普通白菜、豇豆、葡萄和香蕉为基质，对净化方法和稀释方法进行了优化（表5）。

由表5 可知，样品采用稀释的方法时2 种农药的回收率为80.0%~108.0%；采用PSA、GCB 2 种净化方式时，2 种农药的回收率为80.7%~98.9%。基于环保节能考虑，本试验选择稀释的方法，以减小基质效应。

表5 不同净化方式对赤霉素和高效氯氰菊酯的回收率 （单位：%）

3.4 方法学考察

3.4.1 标准曲线线性范围和检出限 将上述配制成质量浓度0.010、0.050、0.100、0.200、0.400 mg/kg 的系列基质混合标准工作溶液，按照“3.1”所述LCMS/MS 仪器优化条件上机检测，以待测化合物定量离子的峰面积y为纵坐标、质量浓度x为横坐标作标准曲线，得到2 种农药的线性方程及相关系数。结果表明，赤霉素和高效氯氢菊酯在0.010~0.400 mg/kg 质量浓度范围内与对应的峰面积呈良好线性关系（R2>0.999），线性回归方程和相关系数见表6。

在空白基质中添加混合标准溶液，上机检测，以3 倍信噪比（S/N≥3）计算该方法的检出限（LODs），以10 倍信噪比（S/N≥10）计算该方法的定量下限（LO⁃Qs）［12，13］，相关结果见表6。由表6 可知，2 种农药在各个基质残留的检出限（LODs）范围均为0.001 mg/kg，定量限（LOQs）范围均为0.004 mg/kg，该方法的灵敏度可满足蔬菜水果中赤霉素和高效氯氢菊酯残留的检测要求。

表6 2 种农药在4 种基质中的回归方程、相关系数、检出限和定量限

3.4.2 回收率和精密度 取空白普通白菜、豇豆、葡萄、香蕉样品，按0.040、0.100、0.400 mg/kg 3 个水平进行加标回收试验，按“2.2”进行前处理，每个水平测定6 次，对其测定值进行回收率和相对标准偏差（RSD）计算，其结果见表7。由表7 可知，2 种农药的回收率为80.0%~112.1%，相对标准偏差（RSD）为1.06%~13.58%。

表7 2 种农药在基质中的平均加标回收率和相对标准偏差

3.5 实际样品测定

采用本研究所建立的方法对普通白菜、豇豆、葡萄、香蕉等样品共20 份进行检测，结果表明，有2 个普通白菜检出高效氯氰菊酯值分别为2.70 mg/kg 和5.71 mg/kg，其他未发现有赤霉素和高效氯氰菊酯农药检出。其原因可能是普通白菜容易生虫，豇豆没有检出是因为海南省近年来对豇豆管理比较严格，海南省农业农村厅对豇豆从种到收都进行严格管控和质量安全技术指导，种植技术也日益成熟。在葡萄和香蕉中没有检出是因为种植技术成熟及目前种植多为规模化种植，基地在栽培技术及农药喷施管理方面相比种植散户更加规范，因此在抽检的10 个样品中没有检出。

4 小结与讨论

QuEChERS 是当前果蔬农药残留分析中最前沿的前处理方式，其原理是利用净化剂与试样中杂质间的互相作用，吸附杂质而达到净化的目的。其主要操作步骤为：样品经乙腈提取，氯化钠和无水硫酸镁盐析分层，PSA 吸附净化，过膜得待测液。本研究基于普通白菜、豇豆、葡萄和香蕉4 种基质，对QuEChERS 方法进行了优化。首先，以乙腈为提取剂，只加氯化钠盐析分层，不加无水硫酸镁，结果表明农药回收率符合要求，同时避免了加无水硫酸镁会发热结块、难混匀且使一些不耐热农药降解的情况发生。其次，对净化剂进行选择。净化时加200 mg PSA 和100 mg GCB，虽然能够减少样品中糖类、有机酸、色素等成分，干扰物质的减少有利于降低方法检出限，提高试验结果准确度，但通过稀释的方式也可以达到相同的效果。而PSA 和GCB 商业试剂包贵，批样处理消耗大，成本高，不适合一般的样品检测。基于环保和提高工作效率考虑，采用了稀释降低基质效应减少干扰物的方法。

本研究以优化的QuEChERS 为前处理方式，样品经乙腈提取，50%甲醇1∶1（V/V）稀释，结合LCMS/MS 法对普通白菜、豇豆、葡萄、香蕉中赤霉素和高效氯氰菊酯同时进行定性定量分析。采用基质匹配标准曲线进行定量，在0.010~0.400 mg/L 范围内，赤霉素和高效氯氰菊酯线性关系良好，相关系数R2>0.999。方法平均回收率为80.0%~112.1%，RSD为1.06%~13.58%；检出限为0.001 mg/kg，定量限为0.004 mg/kg。该方法前处理操作便捷、试剂消耗少，精密度、准确度和灵敏度均符合残留试验要求，可为同时测定蔬菜和水果中的赤霉素和高效氯氰菊酯残留提供方法参考。