湘西地区山羊泰勒虫流行病学调查及种类鉴定

李 晖，宋金秋，汤国祥，吴阳祥，张大军，王晓平，向晓寒，王 霞，贺 兰，侯强红

（1.湘西民族职业技术学院，湖南 吉首 416000；2.益阳市赫山区畜牧工作站，湖南 益阳 410013；3.凤凰县两林乡人民政府，湖南 凤凰 416211；4.华中农业大学动物医学院，武汉 430070；5.怀化职业技术学院，湖南 怀化 416000）

泰勒虫是一种可经蜱传播的血液原虫，该病原可寄生在反刍动物（如牛、羊）的巨噬细胞、淋巴细胞和红细胞内，引起严重的临床症状，如贫血、高热和消瘦等，严重时可导致病畜死亡，造成巨大的经济损失［1，2］。羊泰勒虫首次报道于埃及，目前该病原在全世界广泛流行，且羊泰勒虫有多个种，如绵羊泰勒虫（Theileria ovis）、莱氏泰勒虫（Theileria lestoquardi）、吕氏泰勒虫（Theileria luwenshuni）和隐藏泰勒虫（Theileria recondita）等。不同地区羊群中泰勒虫的优势种存在差异，如甘肃地区羊泰勒虫优势虫种为吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫［3］，而新疆羊群中绵羊泰勒虫为优势虫种，且其阳性率高达62.64%［4］，以上已有结果说明中国羊群泰勒虫感染情况较为复杂且严重。

湘西自治州地处湖南省西部，该地区牧草资源丰富，为当地山羊养殖业的发展提供了天然的有利条件。湘西地区的山羊养殖发展迅速，其饲养量已超过120 万头，年产值愈亿元，山羊养殖为湘西自治州当地经济发展作出了巨大的贡献［5］。为了对湘西地区山羊泰勒虫的流行情况进行调查及种类鉴定，本研究从该地区12 个养殖场共收集204 份山羊血液样品，应用PCR 法检测泰勒虫的流行情况，并随机挑选16 个虫株18S rRNA 序列PCR 产物进行测序与分析，初步明确该地区山羊泰勒虫的种类，以期为该地区山羊泰勒虫病的防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样本来源

根据湘西山区的自然地理地貌和山羊养殖特点，于2018 年8 月至2019 年8 月分别从湖南省湘西自治州的凤凰县、花垣县、保靖县部分养殖场（每个县随机挑选4 个养殖场）随机无菌采集204 份山羊血样，其中凤凰县、花垣县和保靖县采集样品数量分别为86 份、61 份和57 份，样品标记后低温送至华中农业大学国家重点实验室，待检。

1.2 主要试剂

TIANamp Genomic DNA Kit（产品编号：DP304-03，北京）购自天根生化科技（北京）有限公司；50×TAE 电泳缓冲液购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；琼脂糖、DL2000 DNA Marker 和2×Super PCR Mix 购自北京擎科新业生物技术有限公司。

1.3 基因组DNA 提取及PCR 检测

血液基因组DNA 的提取步骤按照DNA 提取试剂盒说明书进行，提取的基因组DNA 保存于-20 ℃。利用泰勒虫属特异性引物18S rRNA-F：5′-AACCT⁃GGTTGATCCTGCCAGTAGTCAT-3′和18S rRNA-R：5′-GATCCTTCTGCAGGTTCACCTAC-3′扩增该原虫18S rRNA 基因的V4 高变区，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR 体系（50 μL）包括：PCR预混液25.0 μL、上下游引物（10 pmol/L）各2.0 μL、基因组DNA 3.0 μL 和去离子水18.0 μL，反应条件为94 ℃5 min；94 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃1 min，共35 个循环；72 ℃7 min，每个反应均设置阳性对照和阴性对照，其中阳性对照基因组DNA 来源于绵羊泰勒虫，阴性对照基因组设置为去离子水，PCR 反应结束后取5.0 μL 产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳，并观察结果。

1.4 序列比对及遗传进化分析

挑选具有代表性的阳性样品送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行双向测序，使用DNAstar软件对获得的序列进行拼接，同时与GenBank 收录的相应序列进行同源性比较，应用MEGA 7.0 软件中的邻接法（Neighor-joining）构建种系发育树，boot⁃strap 值设置为1 000。

2 结果与分析

2.1 PCR 检测结果

采用泰勒虫属通用检测引物18S rRNA-F/18S rRNA-R 对采自湘西地区的204 份样品进行了PCR检测，结果发现，共167 份样品检测为泰勒虫病阳性，其平均检出率为81.86%。凝胶电泳结果显示扩增片段大小约400 bp，无非特异性条带，且阳性对照和阴性对照均成立。部分样品PCR 产物凝胶电泳结果如图1 所示。

图1 羊泰勒虫样品18S rRNA 基因序列PCR 扩增结果

2.2 湘西地区山羊泰勒虫分子流行特点分析

分子流行病学调查结果（表1）显示，湘西地区山羊泰勒虫阳性率为81.86%。进一步分析该地区山羊泰勒虫的分子流行病学特征，结果发现，凤凰县、花垣县、保靖县羊泰勒虫病阳性率差异较小，分别为82.56%、77.05%和85.96%。此外，不同品种山羊泰勒虫病感染率较为一致，黑山羊和本地山羊阳性率分别为79.52%和83.47%；但不同饲养模式羊群泰勒虫病阳性率存在一定差异，其中舍饲山羊和散养山羊泰勒虫病感染率分别为75.78% 和92.10%。

表1 湘西地区山羊泰勒虫病分子病学流行分析结果

2.3 湘西地区山羊泰勒虫虫种鉴定结果

本研究从被调查的12 个羊场中随机抽选了16份PCR 阳性样品（每个羊场1 份样品）进行测序鉴定虫种，测序结果发现，所有样品扩增的18S rRNA 序列大小基本一致，为396~400 bp，核苷酸序列同源性为 99.70%~100.00%，且与吕氏泰勒虫分离（KY973285）核苷酸序列同源性均超过99.50%，但与其他充足分离株对应序列同源性相对较低；进一步遗传进化分析结果（图2）显示，本研究获得的样品与已知吕氏泰勒虫分离株属于同一分支，与其他虫株所属分支相隔较远，提示本研究获得的虫株样品均为吕氏泰勒虫。

图2 基于18S rRNA 基因序列构建吕氏泰勒虫系统进化树

3 小结与讨论

泰勒虫病在牛羊养殖过程中较为常见，泰勒虫病病原-泰勒虫主要感染宿主（如牛、羊）的巨噬细胞、红细胞和淋巴细胞，导致病畜出现高热、贫血和消瘦，部分发病动物可出现体表淋巴结肿大，甚至死亡［1］。大量研究表明，中国羊泰勒虫流行情况十分严重，但不同地区流行情况差异较大，如新疆阿勒泰地区［6］羊泰勒虫病阳性率为23.3%，吉林省部分地区［7］羊血液样品中泰勒虫病原检出率为28.08%，但四川省攀西地区［8］山羊泰勒虫阳性率高达73.44%，部分县（市）羊群阳性率达100.0%，说明泰勒虫病在中国不同地区分布广泛且严重，相应的流行病学调查将有利于防控措施的制定与实施。

目前，山羊养殖业在湘西地区畜牧业中一直占有重要的地位，但近年来频发疑似羊泰勒虫病的案例给当地养殖户造成了较大的经济损失。目前针对泰勒虫PCR 诊断的分子标记基因有很多，其中18S rRNA 基因序列因其在寄生虫的生物进化过程中较为稳定，同时也具有高变性，可作为理想的分子标记用于虫种鉴定和遗传变异等研究［9，10］。为初步调查湘西地区山羊泰勒虫病流行情况，本试验应用PCR 技术对该地区的204 份山羊血液样品泰勒虫病流行情况进行调查与种类鉴定。结果发现，该地区羊泰勒虫病原18S rRNA 基因检出率为81.86%，本文调查结果高于吉林省［7］和陕西省［11］部分地区。分析湘西地区山羊泰勒虫病感染情况如此严重可能有以下原因：该地区畜牧养殖业较为发达，但养殖水平较低，导致疫病多发；湘西地区多山和树丛，同时气候较适合蜱虫的繁殖，而蜱虫是泰勒虫的重要传播媒介［12］，这导致羊群在采食过程中感染泰勒虫病的几率提高；当地养殖户忽视对羊泰勒虫病的防控。进一步对被调查样品进行不同地区、品种及饲养模式的比较分析，发现不同品种和地区羊群感染率差异较小，这可能与当地山羊跨县交易较为频繁，且不同山羊品种对泰勒虫易感性差异较小等有关，但舍饲羊群较散养羊群感染率低，其原因可能是尽管泰勒虫在该地区羊群中流行情况较为严重，但散养羊群较舍饲羊群接触到病原或其宿主（蜱虫）的几率更大［7］。

本研究通过对部分泰勒虫样品18S rRNA 基因序列进行测序与分析，发现其基因序列与吕氏泰勒虫参考株同源性均高于99.50%，且进一步的系统进化分析结果表明它们位于同一分支，因此可确定本文测序的16 份山羊源泰勒虫样品均为吕氏泰勒虫，但未检出其他泰勒虫，提示该地区羊群中吕氏泰勒虫为优势虫种，其结果与袁延庆等［13］和田万年等［7］调查结果基本一致，但与孟林明等［12］报道吕氏泰勒虫与其他泰勒虫混合感染这一情况存在差异。由于本研究未对所有泰勒虫PCR 阳性样品进行测序，故无法确定该地区羊群是否感染其他泰勒虫。本文调查结果为湘西地区山羊泰勒虫病的防控提供了科学依据，但该地区羊群是否感染除吕氏泰勒虫外其他虫株还需要进一步研究。