环割对马家柚蔗糖和柠檬酸含量及其相关基因表达的影响

赵连鑫，王 鑫，何 彩，牟德生，郭艳兰，史星雲，韩登山，姚元文

（1.武威市林业科学研究院，甘肃 武威 733000；2.华中农业大学 园艺林学学院，湖北 武汉 430070；3.湖州市农业科技发展中心/湖州市农业科学研究院，浙江 湖州 313000）

环割是果树栽培管理中常用的一种技术措施，具有保花保果和提高果实品质的作用。环割时间和圈数是影响环割效应的主要因素，笔者前期对不同环割时间、环割圈数对马家柚（Citrus grandisL.Osbeck）环割试验表明，不同环割处理对马家柚果实糖酸的影响显著［1］。柑橘果实中主要含有蔗糖和果糖等［2］，其中，柚类果实中蔗糖含量最高，糖含量的变化与糖代谢途径中相关的酶有着紧密的联系，因而决定果实中糖含量的酶有很多。

20世纪90年代，在玉米和菠菜中对植物细胞质进行纯化得到了蔗糖磷酸化酶SPS［3］，它可催化果糖转化为蔗糖，在香瓜中也证实了这一点［4］。蔗糖转运蛋白（SUC）是质膜上转运蔗糖的载体，与蔗糖的装卸有密切关系［5-6］。SUC是一个多成员的基因家族［7］，根据不同的性质将其分成3个亚族：SUC1、SUC2、SUC3和SUC4，它们在植物的不同组织和器官中存在着不同的表达。有机酸的代谢是一个复杂的过程，有很多相关的酶参与其中，不同的酶在果实的有机酸代谢中起着不同的作用。柑橘果实存在着丰富的有机酸，主要有柠檬酸、苹果酸和乙酸等［8-9］，其中柠檬酸是柑橘果实中含量最多的有机酸。文涛等［10］在脐橙果实酸代谢研究中发现，CS的表达与柠檬酸的代谢存在着正相关，但也有研究发现［11］，CS的表达与果实柠檬酸的含量无关，说明在不同品种中相同的基因有着特异性的表达，这也决定了在不同的果树品种中研究每个基因的必要性。ACO又称乌头酸水合酶，研究发现在果实中它具有2种形态：线粒体ACO和胞质ACO［12］，其表达量与柠檬酸密切相关［13］，在甜来檬研究中发现，它与柠檬酸的含量呈负相关［14］。

为了解环割对柚子果实糖、酸含量变化的原因，本研究以马家柚为试材，设置不同环割时间和圈数处理，选择与糖酸相关的SUC1、SUC2、SUC3、SUC4、CS、ACO等6个基因，研究了环割对马家柚果实中糖、酸（蔗糖、柠檬酸）含量的变化及相关基因的表达情况，以期明确环割后相关基因的表达与糖酸含量变化的关系，从而分析了环割措施对提高果实品质的原因。

1 材料与方法

1.1 材料及处理

试验地概况：试验地设在江西省广丰区瀛洲农业公司基地，位于江西省上饶市广丰区，属亚热带季风气候，年平均无霜期266 d，年平均气温17.9℃，年平均降雨量1661.6 mm，土壤以红壤、黄壤为主。基地果园内只栽植马家柚，浇水、施肥和病虫害防治等统一管理。

试验材料选择树势、挂果量一致的10年生柚树，在第1次生理落果期（5月15日）和第2次生理落果期（6月15日）进行环割处理，设环割1、2、3圈处理，每株只环割3个粗度一致的主枝，在主枝基部处进行环割，环割刀口宽度1 mm，圈距2 cm，每个处理3株。果实成熟后（11月15日），采集环割枝上同一方位、同一大小、同一成熟度的果实，取果实中部果肉液氮处理后，用于糖酸含量和糖酸相关基因表达量的测定。

1.2 试验方法

1.2.1 糖酸含量的测定 果实中糖和酸采用气相色谱仪（Agilent 6890N）测定，具体方法参考文献［15］；色谱条件：HP-5色谱柱，分流/不分流进样口温度270 ℃，检测器温度300 ℃；气体流速：高纯N2作载体，流量为45 mL/min；H2的流量为40 mL/min，空气流量为450 mL/min，柱头压12.00 psi，进样量1 μL，分流比30∶1，分流流速60.1 mL/min；在升温程序中，初温130 ℃，以8 ℃/min升至152 ℃，12℃/min升至176 ℃，16 ℃/min升至198 ℃，20 ℃/min升至238 ℃，24 ℃/min升至280 ℃，280 ℃保留4 min，最大温度不超过325 ℃。

1.2.2 糖酸相关基因筛选及引物设计 从NCBI数据库中，筛选出与柑橘糖、酸代谢相关基因序列7条，其中蔗糖磷酸化酶1条（SPS）、蔗糖转运因子3条（SUC1/SUC3/SUC4）、乌头酸水合酶1条（ACO）、柠檬酸合成酶1条（CS4），用Primer Express 3.0软件设计定量引物，以Actin为内参基因，其中内参基因及所选定量引物序列如表1所示。

表1 糖酸代谢相关基因引物用于Real-time PCR的引物

1.2.3 qRT-PCR测定 用中量法提取果实中的RNA，方法参考徐文欣［16］的研究，再经qRT-PCR测定，测出糖酸相关基因的表达量。

1.3 数据统计分析

采用Excel 2007、SAS软件（SAS System Release 8.1）进行数据统计和差异显著性分析，采用Primer Express 3.0软件设计糖酸相关基因引物。

2 结果与分析

2.1 果实蔗糖和柠檬酸的测定

由表2可知，不同环割处理果肉蔗糖含量均高于对照，蔗糖含量由高到低依次为：Ⅱ-1＞Ⅰ-3＞Ⅱ-3＞Ⅱ-2＞Ⅰ-1＞Ⅰ-2＞CK，Ⅱ-1、Ⅰ-3和Ⅱ-3处理的蔗糖含量较对照分别提高33.5%、13.7%、11.3%，差异显著。果实中柠檬酸的含量由高到低依次为：Ⅱ-1＞Ⅰ-3＞Ⅰ-1＞CK＞Ⅱ-2＞Ⅰ-2＞Ⅱ-3。与CK相比，Ⅱ-1处理的柠檬酸含量最高，比对照高44.1%，差异显著，Ⅱ-3处理的柠檬酸含量最低。

表2 环割处理后果实中可溶性糖、有机酸含量比较

2.2 对糖相关基因表达的影响

图1显示了马家柚果实成熟期蔗糖相关基因的表达情况，A、B、C、D分别为CsSPS（蔗糖磷酸化酶）、CsSUC1、CsSUC3和CsSUC4（蔗糖转运酶）。

图1A显示了各环割处理对马家柚果实成熟期（180 DAF）CsSPS表达的影响。与CK相比，不同环割处理对CsSPS的表达量有升高也有降低的作用，Ⅱ-3处理对CsSPS的表达量最大，比对照高54%；Ⅰ-2和Ⅱ-1处理的表达量最低，比对照低63%和30%，其他处理与对照差异不显著。各处理CsSPS的表达量与该处理下的蔗糖含量不一致。

图1B显示了各环割处理对马家柚果实成熟期（180 DAF）CsSUC1表达的影响。与CK相比，Ⅱ-3处理显著提高了CsSUC1的表达量，提高了144.1%，其他环割处理也提高了CsSUC1的表达量，与该处理下蔗糖的含量表现较为一致。

图1C显示了每种环割处理对马家柚果实成熟期（180 DAF）CsSUC3表达的影响。与CK相比，不同环割处理对CsSUC3的表达有升高也有降低的作用，与各处理下蔗糖的含量不一致。

图1D显示了各环割处理对马家柚果实成熟期（180 DAF）CsSUC4表达的影响。与CK相比，不同环割处理对CsSUC4的表达有升高也有降低的作用，各处理中CsSPS的表达量与该处理下蔗糖的含量不一致。

图1 不同环割处理下果实中蔗糖相关基因表达量的比较

2.3 对酸相关基因表达的影响

图2显示了马家柚果实成熟期（180DAF）柠檬酸代谢相关基因的表达情况，本课题组的前期研究表明：CsCS4（柠檬酸合成酶）和CsACO1（乌头酸水合酶）2个基因在柠檬酸代谢途径中具有重要作用。

图2A显示了环割处理对马家柚果实成熟期（180 DAF）CsCS4表达的影响。与CK相比，各环割处理对CsCS4表达有影响，Ⅰ-2处理下的CsCS4表达量显著高于其他处理和CK，与该处理下柠檬酸含量表现不一致。

图2B显示了环割处理对马家柚果实成熟期（180 DAF）CsACO1表达的影响。与CK相比，不同的环割处理对CsACO1的表达有影响，Ⅱ-3处理显著提高了CsACO1的表达量，高于对照26%，Ⅱ-1处理显著降低了CsACO1的表达量，低于对照13%，与该处理下果实中柠檬酸含量较一致；其他处理对CsACO1的表达量，与该处理下果实中柠檬酸含量表现也较为一致。

图2 不同环割处理下果实中柠檬酸相关基因表达量的比较

3 讨论与结论

环割作为一种常用的栽培技术手段，已广泛应用于生产，其对果实品质的影响主要表现在对糖、酸含量的变化上，相关的研究甚多［17-18］，具有升糖、降酸的效果，且可溶性糖上升的效果最显著。本研究表明：不同的环割处理对马家柚果实中蔗糖和柠檬酸含量均有影响，各环割处理均提高了果实中蔗糖的含量，Ⅱ-1、Ⅰ-3 和Ⅱ-3 处理的蔗糖含量分别较CK 高33.5%、13.7%、11.3%，且差异显著。果实中柠檬酸含量中Ⅱ-1 处理的柠檬酸含量最高，比CK 高44.1%，且差异显著；Ⅱ-3 处理的柠檬酸含量最低，这与涂美艳等［17］的研究结果一致，即环割对可溶性糖与总酸含量的表现一致。

另外，本研究还表明，环割对马家柚蔗糖和柠檬酸相关基因表达的影响，与CK相比，环割处理后CsSPS、CsSUC1、CsSUC3和CsSUC4这4种基因的表达有升高也有降低的作用，其中，环割处理后CsSUC1的表达量与各处理下的蔗糖含量基本一致，其他3个蔗糖相关基因表达与蔗糖含量不一致。因此认为，环割处理可能对CsSUC1表达的影响较大，从而改变了果实中蔗糖的含量。环割对柠檬酸代谢相关基因的研究结果表明：环割对马家柚果实中柠檬酸相关基因表达有影响，其中，环割处理后CsACO1的表达量与各处理柠檬酸含量基本一致，因此认为，环割处理中可能对CsACO1表达的影响较大，从而改变了果实中柠檬酸的含量。

综上所述：环割处理果肉中蔗糖含量均高于对照，Ⅱ-1、Ⅰ-3和Ⅱ-3处理蔗糖含量较对照分别提高33.5%、13.7%、11.3%，差异显著。第2次生理落果期环割1圈果实中柠檬酸含量最高，高于对照44.1%，差异显著；第2次生理落果期环割3圈果实中柠檬酸的含量最低。环割处理对蔗糖和柠檬酸相关基因的表达影响显著，其中环割处理引起CsSUC1和CsACO1表达量的变化，可能与马家柚果实中蔗糖和柠檬酸含量变化密切相关。