绣球菌菌丝体液态发酵培养工艺条件优化

王 斌,吕晗琪,张腾霄,桑亚姣,张春华,李 爽

(绥化学院 食品与制药工程学院, 黑龙江 绥化 152061)

绣球菌(Sparassis crispa)隶属于非褶孔菌目、绣球菌科、绣球菌属，又名绣球蘑、地花蘑、白绣球花、花椰菜菌等，是珍稀名贵药食两用菌[1]，蛋白质、碳水化合物、维生素和氨基酸等营养物质丰富，具有免疫调节、抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗氧化、抗辐射、降血糖、降血脂、保肝等多种功能[2]。绣球菌中维生素E含量位居菌类前列，还含有麦角固醇。近年来，国内外学者深入研究了绣球菌生物学特性和营养生理特性。继日本和韩国后，我国多地已实现了绣球菌的工厂化栽培，但栽培种为固体菌种[3～4]。液体菌种相对于固体菌种而言，具有菌种纯度高、菌龄一致、周期短和易于工业化培养等优点，推广应用成为行业主流。笔者通过单因素试验基础上采用正交试验分析法，优化绣球菌菌丝体液态发酵培养条件，确定最佳工艺参数，为绣球菌进一步开发利用及工厂化生产提供理论依据。

1 材料

1.1 材料

绣球菌菌种由绥化学院食品与制药工程学院微生物学实验室提供。

1.2 培养基

马铃薯葡萄糖培养基(PDA)：马铃薯100 g,葡萄糖10 g，水500 mL。改良马丁氏培养基：蛋白胨2.5 g,葡萄糖10 g,磷酸氢二钾0.5 g,酵母浸粉1 g，硫酸镁0.25 g，水500 mL。查氏培养基：硝酸钠1.5 g，磷酸氢二钾0.5 g，硫酸镁0.25 g,氯化钾0.25 g,硫酸亚铁0.005 g，蔗糖15 g，水500 mL。玉米汁培养基：玉米粉10 g,蔗糖7.5 g，磷酸二氢钾1 g，硫酸镁0.25 g，水500 mL。豆粉蔗糖培养基：豆粉10 g，蔗糖12.5 g，水500 mL。

1.3 主要仪器

FA2104电子天平，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；SW-CJ-2F双人双面净化工作台，苏州净化设备有限公司；YXQ-LS-50SII型立式压力蒸汽灭菌器，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；ZP-42 振荡培养摇床，苏州市国飞实验室仪器有限公司。

2 方法

2.1 发酵培养基初筛

以PDA培养基(A)、改良马丁氏培养基(B)、查氏培养基(C)、玉米汁培养基(D)、豆粉蔗糖培养基(E)等5种液体培养基为初筛对象，按1.2进行配置，每瓶100 mL，121 ℃高压蒸汽灭菌15 min，冷却至24 ℃左右在超净工作台进行接种，每瓶定量接种5 mL绣球菌菌丝体种子液，于24 ℃、130 r/min条件下无光恒温振荡培养7 d，抽滤(所有样品均以200目尼龙滤布为介质真空抽滤3min)收集菌丝体并称重(湿重)，平行3次。

2.2 发酵工艺参数的单因素优化

2.2.1 发酵温度 按2.1优化的培养基，每瓶接种5 mL绣球菌菌丝体种子液，振荡速度130 r/min、发酵7 d，无光振荡培养，考察发酵温度18 ℃、20 ℃、22 ℃、24 ℃、26 ℃对绣球菌菌丝体产量(湿重)的影响，平行3次。

2.2.2 振荡速度 按2.1优化的培养基，每瓶接种5 mL绣球菌菌丝体种子液，发酵温度24 ℃、发酵7 d，无光旋转式振荡培养，考察振荡速度90 r/min、110 r/min、130 r/min、150 r/min、170 r/min对绣球菌菌丝体产量(湿重)的影响，平行3次。

2.2.3 发酵时间 按2.1优化的培养基，每瓶接种5 mL绣球菌菌丝体种子液，发酵温度24 ℃、振荡速度130 r/min，无光振荡培养，考察发酵7 d、9 d、11 d、13 d、15 d对绣球菌菌丝体产量(湿重)的影响，平行3次。

2.3 发酵液体培养基的优化及复筛

2.3.1 碳源对菌丝体生长的影响 按2.2优化的结果，分别加入不同碳源(1～5)，以菌丝体产量(湿重)为参考指标，平行3次。各组的碳源组成设计如下：1：马铃薯浸提液+2%葡萄糖；2：马铃薯浸提液+2%蔗糖；3：马铃薯浸提液+2%松木屑提取液；4：马铃薯浸提液+2%麦芽糖；5：马铃薯浸提液+2%果糖。

2.3.2氮源对菌丝体生长的影响 按2.2优化的结果，分别加入不同氮源(1～5)，以菌丝体产量(湿重)为参考指标，平行3次。1：马铃薯浸提液+2%蔗糖+0.3%氯化铵；2：马铃薯浸提液+2%蔗糖+0.3%蛋白胨；3：马铃薯浸提液+2%蔗糖+0.3%酵母浸粉；4：马铃薯浸提液+2%蔗糖+1%黄豆粉；5：马铃薯浸提液+2%蔗糖+1%玉米粉。

2.3.3 无机盐对菌丝体生长的影响 按2.2优化的结果，分别加入不同无机盐(1～5)，以菌丝体产量(湿重)为参考指标，平行3次。1：马铃薯浸提液+2%蔗糖+0.3%蛋白胨+0.2%KH2PO4；2：马铃薯浸提液+2%蔗糖+0.3%蛋白胨+0.2%KH2PO4+0.05%MgSO4；3：马铃薯浸提液+2%蔗糖+0.3%蛋白胨+0.2%NaH2PO4；4：马铃薯浸提液+2%蔗糖+0.3%蛋白胨+0.2%NaH2PO4+0.05%MgSO4；5：马铃薯浸提液+2%蔗糖+0.3%蛋白胨+0.2%NaH2PO4+0.05%KCl。

2.4 正交实验设计

在单因素试验基础上，选择对绣球菌菌丝体液态发酵工艺培养影响较大的因素进行L9(34)正交试验，确定绣球菌菌丝体液态发酵最佳培养工艺条件。

3 结果与分析

3.1 发酵培养基初筛结果

不同液态培养基对绣球菌菌丝体生长的影响见图1、图2。

图1 不同液态培养基对绣球菌菌丝体生长的影响

图2 不同液态培养基对绣球菌菌丝体生长的影响

图1和图2可知，不同液态培养基对绣球菌菌丝体生长的影响存在明显差异，PDA培养基中绣球菌菌丝体形成球状且菌丝球密度最高，其次为玉米汁培养基，而查氏培养基中绣球菌菌丝体几乎不生长，改良马丁氏培养基和豆粉蔗糖培养基的结果相近，但明显不如PDA培养基，因此，后续正交设计实验选择PDA为基础培养基。

3.2 发酵工艺参数的单因素优化结果

发酵温度、振荡速度、发酵时间优化结果分别见图3、图4、图5。不同种类的碳源、氮源、无机盐对菌丝体生长的影响分别见图6、图7、图8 。

图3 培养温度对绣球菌菌丝生长的影响

图4 振荡速度对绣球菌菌丝体生长的影响

图5 发酵时间对绣球菌菌丝体生长的影响

图6 碳源对绣球菌菌丝体生长的影响

图7 氮源对绣球菌菌丝体生长的影响

图3可知，18～26℃范围内随着发酵温度升高，绣球菌菌丝体生长速度随之加快，提高温度能够显著刺激菌丝体生长。绣球菌主栽品种属低温出菇型品种，出菇期温度需保持13～20 ℃，但在液态发酵培养模式下其菌丝体生长阶段却需要较高生长温度。因此，后续正交设计实验发酵温度设置为26 ℃。

图4可知，振荡速度是影响绣球菌菌丝体生长的重要因素，在90～150 r/min范围内，菌丝体的生长随振荡速度提高而增加，但170 r/min时反而减小。振荡转速主要影响溶氧效率、养分的均匀分布和菌丝断裂程度，较高转速会造成菌丝断裂频率过高及机械碰撞损伤过度，断裂处无法形成有效生长点。绣球菌是典型的好氧真菌，结果表明，液态发酵培养最适振荡速为150 r/min，此条件既保障了充足氧气供应，又不会对菌丝造成机械损伤。

图5可知，发酵时间对绣球菌菌丝体生长影响较显著，7～13 d持续保持较高的生长速率，但13 d后生长速度明显变缓，再增加发酵时间对收获菌丝体的贡献不大，且造成菌丝衰老，从节约时间提高效率角度，发酵时间适宜选择13 d。木耳、香菇、金针菇及侧耳等其它常见食用菌发酵至7 d便趋于平缓(即可收获菌丝体)，绣球菌与其相比菌丝体生长缓慢，收获时间滞后约6 d。

图6可知，碳源对绣球菌菌丝体生长影响显著，葡萄糖和蔗糖效果最好，其次为麦芽糖、松木屑提取液，果糖最差，说明绣球菌菌丝体对各种碳源吸收及利用存在显著差异。由于考察碳源的种类不同，本实验结果与林衍铨等[5]研究的结果基本一致，但与元玲刚等[6]研究的结果略有差异。

图8 无机盐对绣球菌菌丝体生长的影响

图7可知，不同氮源对绣球菌菌丝体生长影响显著，蛋白胨和黄豆粉为氮源时菌丝体收获量较大，其次为玉米粉、酵母浸粉，而氯化铵效果最差。说明绣球菌对有机氮源的利用效率优于无机氮源。

图8可知，绣球菌对各类无机盐响应不是很敏感，在基础培养基中加入少量磷酸盐、镁盐、钾盐均能略微提高菌丝体的生长速度，其中0.2%磷酸二氢钾+0.05%硫酸镁的组合效果最好，其次为0.2%磷酸二氢钠+0.05%硫酸镁，单用0.2%磷酸二氢钠效果最差。

3.3 多因素正交试验结果

选用L9(34)正交设计对振荡速度、发酵时间、碳源、氮源4个关键因素进行发酵试验，固定发酵温度为26 ℃，以菌丝体产量(湿重)为参考指标，因素水平安排见表1。正交实验结果见表2和表3。

表1 正交试验设计因素及水平

表2 正交试验优化研究直观分析

表3 正交试验的方差分析

由表2和表3可知，各因素中对结果影响的大小顺序为B>A>C>D，最佳实验方案为A2B2C1D3，即最佳液态发酵工艺条件为振荡速度为150 r/min、发酵时间为13 d、碳源为葡萄糖、氮源为玉米粉，以最佳工艺条件进行实验验证，发酵收获的菌丝体鲜重为3.998 g，比初筛的最高值1.968 g高出103.15%，比单因素试验的最高值3.691 g高出8.32%，验证结果达到了期望目标。

以液态发酵法高效获取绣球菌菌丝体及菌种是行业规模化发展的必然需求，对其培养基配方组分及发酵生产工艺进行优化以获得最优工艺条件[7～9]，为实际生产提供全面、可靠的理论依据。

4 结论

以常用的5种真菌培养基为初筛对象，结果显示PDA培养基最好，次为改良马丁氏培养基；再以PDA培养基为基础同时进行发酵工艺因素、培养基配方两个方面的单因素试验，确定了最适温度26 ℃、最佳振荡速度150 r/min、最佳发酵时间13 d、最佳碳源2%葡萄糖、最佳氮源0.3%蛋白胨，最佳无机盐0.2%磷酸二氢钾+0.05%硫酸镁；结合多因素正交试验结果，绣球菌菌丝体最佳液态发酵工艺条件为：PDA培养基、最适温度26 ℃、振荡速度150 r/min、发酵时间为13 d、碳源为葡萄糖、氮源为玉米粉。