乌参醒脑汤对帕金森病大鼠行为学及内质网应激PERK/ATF4通路的影响*

于楠楠，毕海洋，匡禹霏，孙殿甲

（1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江省老年病医院，黑龙江 哈尔滨 150016）

帕金森病（Parkinson's disease, PD）是一种神经系统退行性疾病，多发于老年群体，临床上表现为静止性战栗、运动减少、步态异常等，发病原因较复杂。有研究显示，年龄增长、氧化应激过度等均可引起黑质纹状体系统中多巴胺能神经元变性死亡，促进PD 的发展[1]。目前西医主要通过抗胆碱能药物、多巴胺受体激动剂等对症治疗，用药后症状明显改善，但长期使用毒副作用较大[2]。此外手术治疗也有明显效果，但术后并发症多，且极易复发[3]。近年来，中医治疗PD 有一定成效，并且中药毒副作用低，值得临床参考[4]。中医认为，PD 的病位在脑，病机为本虚标实症，虚症以气血两虚和肝肾亏虚为主，实证在于风、淤、痰[5]。2010 版《中华人民共和国药典》[6]收录了“人参首乌胶囊”一方，具有益气补血、补肝养肾的功效，可治疗神经衰弱、失眠健忘等症。本研究在此方基础上根据临床经验加入黄芪、当归、川芎、银杏叶、三七粉、蒲黄，在补肾养肝的基础上起到通脑络、养气血、通淤堵的作用。本研究探究配伍而成的乌参醒脑汤对帕金森病大鼠的行为学和内质网应激PERK/ATF4 通路的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

48 只雄性SD 大鼠，体重（220±20）g，SPF 级，购自上海昇敞生物科技有限公司。实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2021-0002；实验动物使用许可证号：SYXK（沪）2021-0009。正常饲喂、饮水，适应性饲养1 周。

1.2 主要试剂及仪器

1.2.1 主要试剂乌参醒脑汤方中人参、首乌、黄芪、当归、川芎、银杏叶、三七粉和蒲黄（北京同仁堂大药房），6-羟基多巴胺（6-OHDA）（批号：636-00-0）、盐酸阿扑吗啡（批号：314-19-2）（上海源叶生物科技有限公司），Total RNA Extraction Kit（批号：R1200）、Universal RT-PCR Kit（批号：RP1100）、动物组织总蛋白提取试剂盒（柱式法）（批号：BC3790-50T）、BCA 试剂盒（批号：PC0020）（北京索莱宝科技有限公司），蛋白激酶R 样内质网激酶（protein kinase R-like ER kinase, PERK）、转录活化因子4（activating transcription factor 4, ATF4）、C/EBP 同源蛋白（C/EBP homology protein, CHOP）、B 淋巴细胞瘤-2基因（BCL2-associated X, Bax）、β-actin 兔抗大鼠一抗、HPR 标记羊抗兔IgG 二抗（美国Abcam 公司）。

1.2.2 主要仪器数显式脑立体定位仪DB006-1、SMART 3.0 动物行为学视频分析系统Smart 3.0（北京智鼠多宝生物科技有限公司），光学显微镜Axio Lab.A1（北京普瑞赛司仪器有限公司），Qtower96G 实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR）仪（德国椰拿分析仪器股份公司），全自动样品快速研磨仪-24L（上海净信实业发展有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 乌参醒脑汤的制备称取人参12 g、首乌12 g、银杏叶10 g、黄芪8 g、当归6 g、川芎6 g、三七粉3 g、蒲黄5 g，冷水浸泡30 min，取出沥干水分，置于砂锅中，加适量自来水头煎煮沸后25 min 关火，倒出汤剂，加适量自来水再煎，煮沸后20 min 关火，捞出药渣，将头煎和二煎的汤剂混合，浓缩至20 mL，生药浓度为3.1 g/mL 的混悬液，置于4℃冷藏备用。

1.3.2 模型的复制与鉴定参照张辉等[7]的研究，复制PD 大鼠模型。模型复制前12 h 禁食，用2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，将其固定在脑立体定位仪上，剔去颅顶毛发，沿头部中线切开头皮，暴露颅骨。参考PAXINOS 等[8]的大鼠脑部立体定向图谱，利用定位坐标法定位大鼠左侧纹状体（striatum,CPU）的坐标（前囟后1.00 mm，中线左3.00 mm，硬膜下5.00 mm），于该点向大鼠左侧CPU 内注射0.2%6-OHDA（生理盐水稀释），留针5 min，缓慢退针，缝合好伤口后表面涂抹青霉素防止感染。模型复制3 d 后观察到大鼠步态失调，肢体震颤，行动迟缓，即模型复制成功。

1.3.3 实验分组与给药将48 只大鼠随机分为对照组、模型组、低剂量组、高剂量组，每组12 只。模型复制成功后低剂量组和高剂量组分别灌胃5.4 g/kg和10.8 g/kg 乌参醒脑汤（灌胃前需摇匀并加热至37℃，按照人与大鼠用药剂量换算得出），连续灌胃21 d。对照组灌胃等体积生理盐水，模型组按照1.3.2 方法复制模型后灌胃生理盐水。

1.3.4 大鼠行为学观察①旷场实验[9]：最后一天给药结束后，将大鼠依次入旷场行为箱（160 cm×160 cm×50 cm 的纸箱），箱底有16 个大小一致的方格（40 cm×40 cm），利用行为学视频分析系统记录5 min 大鼠四肢爬过的方格数量，即大鼠的水平运动频率。②旋转实验[10]：旷场实验结束后，于各组大鼠后颈部皮下注射0.5 mg/kg 盐酸阿扑吗啡，注射结束后5 min 开始计时，记录30 min 内大鼠的旋转圈数（360°为1 圈），即大鼠的旋转频率。

1.3.5 苏木精-伊红（hematoxylin-eosin staining,HE）染色观察纹状体组织病理改变旋转实验结束后，待大鼠安静，每组随机选取4 只大鼠，腹腔注射2%戊巴比妥钠溶液麻醉大鼠，迅速取下头部，在冰上解剖分离出脑组织纹状体，放入10%甲醛溶液中浸泡1 周固定，石蜡包埋，切片。取石蜡切片烤干，二甲苯脱蜡处理（2 次，10 min/次），乙醇浸泡脱苯（2 次，5 min/次），蒸馏水洗净乙醇，加苏木精染色15 min，用0.5%盐酸乙醇浸泡30 s，再用蒸馏水冲洗干净，加入0.5%伊红染色10 min，蒸馏水冲洗干净，二甲苯浸泡透明处理（2 次，10 min/次），中性树脂封片，在光学显微镜下观察神经元细胞呈深蓝色。

1.3.6 qRT-PCR检测纹状体PERK、ATF4、CHOP、Bax mRNA 的表达每组随机选取4 只大鼠，腹腔注射2%戊巴比妥钠溶液麻醉，迅速取下头部，在冰上解剖分离出脑组织纹状体，置于2 mL 离心管，加入1 mL 裂解液，放入组织匀浆机中匀浆，匀浆后将离心管在室温放置5 min，使核酸蛋白复合物完全分离，按照Total RNA Extraction Kit 试剂盒说明书进行后续提取，将得到的RNA 用Universal RT-PCR Kit 试剂盒进行逆转录，qRT-PCR 检测mRNA 的表达，反应条件：95℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸2 min，共30 个循环。以β-actin 为内参，每个样品做3 个复孔计算Ct 值的平均数，采用2-ΔΔCt法计算mRNA 相对表达量。各引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.7 Western blotting 检测大鼠纹状体PERK、ATF4、CHOP、Bax 蛋白的表达随机选取每组4 只大鼠，腹腔注射2%戊巴比妥钠溶液麻醉，迅速取下头部，在冰上解剖分离出脑组织中纹状体部分，置于2 mL 离心管中，按照动物组织总蛋白提取试剂盒说明书提取蛋白，利用BCA 法测定蛋白浓度。提取结束后，利用SDS-PAGE 系统进行电泳，β-actin 为内参，转膜，洗膜，5% BSA 蛋白封闭，一抗孵育过夜，洗膜，二抗孵育1 h，显色液显色，曝光分析，利用Image J 系统计算灰度值。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 21.00 统计软件。计量资料以均值±标准差（±s）表示，比较用方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠行为学实验结果比较

模型组与对照组大鼠的旋转频率比较，经t检验，差异有统计学意义（t=9.841，P=0.000），模型组大鼠旋转频率较高。模型组、低剂量组、高剂量组大鼠的旋转频率比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较结果：与模型组相比，低剂量组和高剂量组大鼠旋转频率降低（P＜0.05）；与低剂量组比较，高剂量组大鼠旋转频率降低（P＜0.05）。见表2。

对照组、模型组、低剂量组、高剂量组大鼠的水平运动频率比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较结果：与对照组比较，模型组大鼠水平运动频率降低（P＜0.05）；与模型组比较，低剂量组和高剂量组大鼠水平运动频率升高（P＜0.05）；与低剂量组比较，高剂量组大鼠水平运动频率升高（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠旋转频率比较 （n=12，±s）

表2 各组大鼠旋转频率比较 （n=12，±s）

注：①与对照组比较，P ＜0.05；②与模型组比较，P ＜0.05；③与低剂量组比较，P ＜0.05。

水平运动频率/（格/min）22.40±4.21 12.58±2.18①15.38±2.71①②19.10±3.52①②③20.923 0.000组别对照组模型组低剂量组高剂量组F 值P 值旋转频率/（圈/min）0.00±0.00 10.00±3.52①6.61±2.81①②3.69±1.01①②③16.850 0.000

2.2 各组大鼠纹状体染色结果比较

各组大鼠纹状体病理切片见图1。对照组大鼠纹状体多巴胺能神经细胞元形态正常，结构和轮廓清晰，且数量多。模型组大鼠纹状体多巴胺能神经元细胞数量很少，形态破损严重，多成角状。低剂量组和高剂量组大鼠纹状体多巴胺能神经元细胞数量较多，结构比较完整，轮廓清晰。

图1 各组大鼠纹状体病理切片 （HE×100）

2.3 各组大鼠纹状体PERK、ATF4、CHOP、Bax mRNA相对表达量比较

对照组、模型组、低剂量组和高剂量组大鼠纹状体PERK、ATF4、CHOP、Bax mRNA 相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较结果：与对照组比较，模型组PERK、ATF4、CHOP、Bax mRNA 相对表达量升高（P＜0.05）；与模型组比较，低剂量组和高剂量组PERK、ATF4、CHOP、Bax mRNA 相对表达量降低（P＜0.05）；与低剂量组比 较，高剂 量 组PERK、ATF4、CHOP、Bax mRNA 相对表达量降低（P＜0.05）。见表3。

表3 各组大鼠纹状体PERK、ATF4、CHOP、Bax mRNA相对表达量比较 （n=4，±s）

表3 各组大鼠纹状体PERK、ATF4、CHOP、Bax mRNA相对表达量比较 （n=4，±s）

注：①与对照组比较，P ＜0.05；②与模型组比较，P ＜0.05；③与低剂量组比较，P ＜0.05。

组别对照组模型组低剂量组高剂量组F 值P 值Bax mRNA 0.51±0.05 1.95±0.28①0.95±0.08①②0.87±0.10①②③62.619 0.000 PERK mRNA 0.55±0.04 1.07±0.18①0.71±0.11①②0.65±0.14①②③12.493 0.001 ATF4 mRNA 0.50±0.03 0.97±0.15①0.87±0.12①②0.76±0.15①②③10.870 0.001 CHOP mRNA 0.39±0.03 1.21±0.16①0.89±0.06①②0.75±0.12①②③41.516 0.000

2.4 各组大鼠纹状体PERK、ATF4、CHOP、Bax蛋白相对表达量比较

对照组、模型组、低剂量组和高剂量组大鼠纹状体PERK、ATF4、CHOP、Bax 蛋白相对表达量比较，经方差分析，差异有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较结果：与对照组比较，模型组PERK、ATF4、CHOP、Bax 蛋白相对表达量升高（P＜0.05）；与模型组相比，低剂量组和高剂量组PERK、ATF4、CHOP、Bax 蛋白相对表达量降低（P＜0.05）；与低剂量组比较，高剂量组PERK、ATF4、CHOP、Bax 蛋白相对表达量降低（P＜0.05）。见表4。

表4 各组大鼠纹状体PERK、ATF4、CHOP、Bax蛋白相对表达量比较 （n=4，±s）

表4 各组大鼠纹状体PERK、ATF4、CHOP、Bax蛋白相对表达量比较 （n=4，±s）

注：①与对照组比较，P ＜0.05；②与模型组比较，P ＜0.05；③与低剂量组比较，P ＜0.05。

组别对照组模型组低剂量组高剂量组F 值P 值Bax蛋白0.56±0.06 2.01±0.35①0.98±0.09①②0.81±0.09①②③45.643 0.000 PERK蛋白0.53±0.03 1.12±0.32①0.76±0.14①②0.55±0.12①②③8.740 0.002 ATF4蛋白0.59±0.06 1.51±0.29①0.91±0.09①②0.78±0.11①②③23.413 0.000 CHOP蛋白0.41±0.05 1.39±0.20①0.95±0.08①②0.80±0.10①②③44.557 0.000

图2 各组大鼠纹状体PERK、ATF4、CHOP、Bax蛋白的表达

3 讨论

PD 是以黑质纹状体系统多巴胺能神经元变性丢失为主要特征的神经系统疾病，患者神经元胞质中出现易小体，且纹状体内多巴胺含量减少[11]。PD 一般多发于老年人，表现为肌肉僵直、肢体静止性战栗、运动迟缓并伴有步态变形等临床症状，极大地影响患者生活质量[12-13]。目前，西医常用金刚烷胺、左旋多巴胺等药物治疗PD，但长时间服用该类药物会导致患者产生幻觉、出现意识障碍、刺激肠胃、呕吐等不良反应，部分患者还表现出直立性低血压和下肢水肿的症状。此外，该类药物仅缓解PD 的症状，并不能达到根治的目的。药物治疗效果不佳的患者还可以选择手术治疗，即通过毁损神经核或者进行脑部电刺激，但该方法会产生不可逆损伤，且术后并发症多，极易反复。我国中医研究资料显示，PD 属实虚结合症，实为风、淤、痰，虚为气血两虚和肝肾亏虚。中药的毒副作用少、对肠胃刺激小，因此选择中药方剂或许可以有效治疗PD。

本研究根据药典中收录的“人参首乌胶囊”，另加入六味药材配伍成乌参醒脑汤（人参、首乌、银杏叶、黄芪、当归、川芎、三七、蒲黄）。其中，人参属滋补药，具有祛痰，缓解神经衰弱的作用[14]；首乌具有益精血，补肝肾，祛湿痰的作用[15]；银杏叶可活血养心，疏通脑络[16]；黄芪具有益气敛汗，补脾益肺的作用；当归为补血圣药，可以补血活血治疗血虚诸症；川芎可活血祛瘀，行气开郁；三七可以治气血虚弱；蒲黄可化瘀。八味药材相配伍，起到补气、养血、化瘀、通脑络的作用。

本研究结果显示，模型组大鼠运动迟缓，水平运动频率较低，说明运动受阻，灌服乌参醒脑汤后，水平运动频率升高，说明大鼠运动能力恢复；旋转实验中，低剂量和高剂量给药组大鼠旋转频率下降，高剂量组大鼠旋转频率更低，提示乌参醒脑汤可以降低帕金森病大鼠多巴胺受体敏感性，恢复大鼠运动障碍，且适当增加乌参醒脑汤的剂量效果更佳。二苯乙烯苷是从首乌中提取的主要成分，大量研究显示其对PD 动物模型的行为具有改善作用[17]。本研究结果显示，模型组大鼠纹状体内多巴胺能神经元受损严重且数量少，低剂量组和高剂量组大鼠纹状体内多巴胺能神经元形态良好且数量较多，提示各剂量乌参醒脑汤在不同程度上对神经元具有保护和修复的作用。现代药理学研究发现，人参的主要活性成分是人参皂碱，可以有效抑制神经细胞凋亡[18]；有研究显示，二苯乙烯苷可以提高黑质纹状体系统多巴胺含量，并且对多巴胺能神经元具有保护作用[19]。三七总皂苷是三七的主要活性成分，可以诱导神经干细胞分化成多巴胺能神经元。以上研究与本研究结果均说明乌参醒脑汤具有保护神经元的作用。

内质网应激是一种细胞的保护性应激反应，适当的内质网应激有利于细胞内稳态的平衡，但内质网应激过度则会引起相关细胞凋亡。PERK 是内质网上的一种跨膜蛋白激酶，介导内质网应激，当受到刺激时，PERK 被活化，进而活化ATF4，导致细胞凋亡活化[20]。CHOP、Bax 是参与细胞凋亡的重要因子，活化的ATF4 激活CHOP，CHOP 可以上调Bax 的表达，促进细胞凋亡[21]。本研究结果显示，模型组大鼠PERK、ATF4、CHOP 和Bax mRNA和蛋白相对表达量升高，说明大鼠纹状体内的细胞凋亡途径已被活化，不同剂量的乌参醒脑汤给药对PERK、ATF4、CHOP 和Bax mRNA 和蛋白有不同程度的下调作用。银杏叶提取物具有消除自由基，减少氧化应激的作用，抑制大鼠脑内多巴胺能神经元的减少，对其有保护作用[7]；黄芪的主要活性成分是皂苷类和黄酮类化合物，可以清除体内多余的氧自由基，具有抗氧化应激的作用。黄捷等[22]的研究显示，人参皂苷R3 参与调控内质网应激PERK 通路；另有研究显示，二苯乙烯苷和川芎嗪可以调节Bax 的表达，调控细胞凋亡[23-25]。以上研究结合本研究结果，说明乌参醒脑汤可以抑制PERK/ATF4 通路，从而抑制细胞凋亡

综上所述，乌参醒脑汤具有保护多巴胺能神经元和修复已受损神经元的作用，可以恢复帕金森病大鼠的运动失调，抑制细胞凋亡，这可能与抑制PERK/ATF4 通路有关。