不同支气管冲洗液结核分枝杆菌检测法在菌阴肺结核诊断中的应用价值

高英姿

（武汉市新洲区中医医院，湖北 武汉 431400）

结核病是一种由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染病。结核病可累及患者全身的多个器官，其中累及肺部（肺结核）最为常见。结核病在临床上多表现为慢性病程，少数患者可能存在急性起病的情况[1-2]。结核病的治疗时间较长，抗结核药物的副作用较大，易导致患者机体的免疫力下降，出现一些并发症[3]。当前由于抗生素、糖皮质激素及免疫抑制剂的广泛使用，导致结核分枝杆菌的耐药性不断增强。如何有效检测并控制结核病已成为现阶段临床上讨论的热点问题[4-5]。菌阴肺结核是指至少经3 次痰涂片检查及1次痰培养检查结果呈阴性的一类肺结核[6-7]。作为菌阴肺结核临床诊断的重要措施之一，支气管镜检查不仅能直观地观察患者病灶的情况，还可取其支气管冲洗液进行后续的实验室检查，为本病的诊断及治疗提供重要的参考依据[8]。本文主要是探讨不同支气管冲洗液结核分枝杆菌检测法在菌阴肺结核诊断中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2019 年12 月至2020 年12 月我院收治的60 例疑似患有菌阴肺结核的患者作为研究对象。其纳入标准是：疑似患有菌阴肺结核，存在低热、盗汗、纳差、咳嗽、咳痰、胸痛、胸闷等症状，但无消瘦、咯血、乏力症状；临床资料齐全；知晓本研究内容，并签署了知情同意书。其排除标准是：患有活动性肺结核；合并有恶性肿瘤或其他严重的器质性疾病；存在心、肝、肾、脑等器官功能障碍；存在意识障碍或精神障碍，无法与医护人员正常交流；中途退出本研究或存在其他可能对本研究结果造成影响的因素。在这些患者中，有男性患者33 例，女性患者27 例；其年龄为18 ～31 岁，平均年龄为（25.12±1.22）岁；其临床症状持续的时间为1 ～27 个月，平均时间为（17.14±1.22）个月。

1.2 方法

1.2.1 支气管镜检查 对60 例患者进行支气管镜检查的方法是：对其进行局部麻醉，从鼻腔置入支气管镜。在支气管镜下对患者的肺部、支气管黏膜等进行观察，了解有无异常。经支气管镜的活检孔用5 ～10mL 的生理盐水冲洗肺脏和支气管，随后利用吸引器将冲洗液吸出并置入标本瓶中。

1.2.2 结核分枝杆菌培养 对60 例患者均进行结核分枝杆菌培养，采用全自动结核分枝杆菌培养检测仪实施标本培养及病原菌分离等操作。取患者的支气管冲洗液标本，在血平板与麦康凯平板上接种标本，置于25℃的恒温箱中培养18 ～24 h，观察标本中菌落生长的情况，之后开展革兰染色、菌种分离与鉴定等操作。

1.2.3 涂片法采用涂片法 对患者的支气管冲洗液进行检测的方法是：取支气管冲洗液标本，将其均匀涂抹于载玻片上，之后采用萋- 尼氏染色抗酸染色法进行抗酸杆菌检测。当持续观察300 个视野发现3 条或3 条以上的抗酸杆菌时，可判断检测结果呈阳性，反之则表示检测结果呈阴性。

1.2.4 噬菌体生物扩增法 采用噬菌体生物扩增法对患者的支气管冲洗液进行检测的方法是：用结核分枝杆菌检测试剂盒进行检测，严格按照试剂盒的说明书进行各项检测操作。阳性结果判读：1）噬菌体斑融合，并表现为透明状；2）噬菌斑数量＞20 个。上述条件符合其中任意1 条，即可判断检测结果呈阳性。1.2.5 荧光定量PCR 法 采用荧光定量PCR 法对患者的支气管冲洗液进行检测的方法是：取支气管冲洗液标本，对其进行离心处理，取上清液。将上清液反复沉淀后与无菌生理盐水混合，置于PCR 反应管中实施定量PCR 扩增处理，最后利用KAPA 定量荧光PCR 法对结核分枝杆菌基因的数量进行测定。阳性结果判读：若结核分枝杆菌基因数量超过1×103拷贝/mL，则可判断检测结果呈阳性。

1.3 观察指标

观察对60 例患者进行结核分枝杆菌培养的结果。观察用涂片法、噬菌体生物扩增法和荧光定量PCR法对60 例患者的支气管冲洗液进行检测的结果。比较用涂片法、噬菌体生物扩增法和荧光定量PCR 法诊断菌阴肺结核的效能。

1.4 统计学方法

用SPSS 20.0 软件处理本研究中的数据，计数资料用% 表示，用χ² 检验，计量资料用均数± 标准差（±s）表示，用t检验，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对60 例患者进行结核分枝杆菌培养的结果

对本研究中60 例患者进行结核分枝杆菌培养的结果显示，其中有24 例患者的培养结果呈阳性（表示其患有菌阴肺结核），其余36 例患者的培养结果均呈阴性（表示其患有其他疾病）。

2.2 用涂片法、噬菌体生物扩增法和荧光定量PCR法对60 例患者的支气管冲洗液进行检测的结果

采用涂片法对60 例患者的支气管冲洗液进行检测的结果显示，其中有23 例患者的检测结果呈阳性（表示其患有菌阴肺结核），其余37 例患者的检测结果均呈阴性（表示其患有其他疾病）。采用噬菌体生物扩增法对60 例患者的支气管冲洗液进行检测的结果显示，其中有24 例患者的检测结果呈阳性（表示其患有菌阴肺结核），其余36 例患者的检测结果呈阴性（表示其患有其他疾病）。采用荧光定量PCR 法对60 例患者的支气管冲洗液进行检测的结果显示，其中有27 例患者的检测结果呈阳性（表示其患有菌阴肺结核），其余33 例患者的检测结果呈阴性（表示其患有其他疾病）。详见表1。

表2 用涂片法、噬菌体生物扩增法和荧光定量PCR 法对60例患者的支气管冲洗液进行检测的结果（例）

2.3 用涂片法、噬菌体生物扩增法和荧光定量PCR 法诊断菌阴肺结核的效能

用涂片法诊断60 例患者菌阴肺结核的敏感度为91.67%（22/24）、特异度为97.22%（35/36）、准确率为95.00%（57/60）。用噬菌体生物扩增法诊断60例患者菌阴肺结核的敏感度为87.50%（21/24）、特异度为91.67%（33/36）、准确率为90.00%（54/60）。用荧光定量PCR 法诊断60 例患者菌阴肺结核的敏感度为58.33%（14/24）、特异度为63.89%（23/36）、准确率为61.67%（37/60）。用涂片法、噬菌体生物扩增法诊断60 例患者菌阴肺结核的敏感度、特异度、准确率与结核分枝杆菌培养法的一致性较好，效果较佳，显著优于荧光定量PCR 法。

3 讨论

肺结核是一种危害较大的慢性传染病[9-10]。此病的传播特点是：1）传染性强。作为一种传染性强的疾病，肺结核的传播途径主要是飞沫传染[11]。肺结核患者在打喷嚏、咳嗽或说话时，都有可能将带有结核分枝杆菌的飞沫传播到空气中，健康人在呼吸到被污染的空气之后，就可能发生结核分枝杆菌感染。2）传播速度快。结核分枝杆菌在传播的过程中，若传播途径合适，且患者存在易感体质，结核分枝杆菌就会在短时间内侵入易感人群（如体质较差的婴幼儿、老年人及营养不良者）的体内，其传播速度较快[12]。3）传播的范围广。肺结核患者的病情在确诊之前，会有一段时间的潜伏期。由于本病的传染性较强，且结核分枝杆菌在进入外界环境中也可以长时间存活，因此不需要被感染者与感染者有直接身体接触便可能发生感染[13]。在肺结核诊治的过程中，早期明确诊断此病对治疗方案的选择及提高患者的疗效具有重要的意义[14]。菌阴肺结核患者在患病的早期缺乏特异性的临床表现，且对其进行实验室检查的结果可能呈阴性，因此其病情在持续进展后可能会出现严重的并发症状。因此，临床上对菌阴肺结核进行准确的诊断和及时的治疗至关重要。对菌阴肺结核患者进行支气管镜检查可直观地观察其病灶的情况，还可利用生理盐水冲洗其支气管和肺部，采集冲洗液开展细胞学检查，进而有助于诊断其病情。目前临床上对菌阴肺结核患者的支气管冲洗液进行检测的方法较多，包括涂片法、噬菌体生物扩增法和荧光定量PCR 法等。涂片法属于细菌学检查中最基础的一种方法，即利用石碳酸复红进行初染，随后用盐酸、酒精处理，用碱性美蓝进行复染，此时标本中若含有结核分枝杆菌，则会表现为红色。在结核分枝杆菌的细胞壁中，肽聚糖外周存在大量的脂肪，着色较为困难，且用酸性脱色剂脱色也较为困难，因此通过染色能有效判断标本中是否存在结核分枝杆菌。荧光定量PCE 法即利用荧光标记的寡核苷酸探针或荧光染料，对结核分枝杆菌中的某一特定核酸序列DNA 拷贝数量实施迅速扩增，随后临床医师利用DNA 探针、PCR 杂交技术对荧光的变化进行观察，并记录NDA 模板定量，从而实现结核分枝杆菌检测的一种方法。但该检测方法对检验人员的技术水平、专业知识及经验的要求较高，同时需要有专业的检测设备，故不利于在基层医院推广。噬菌体生物扩增法是一种检测结核分枝杆菌是否存活或耐药的方法。其检测原理是，利用耻垢分枝杆菌作为辅助细菌，在结核分枝杆菌内增殖的子代噬菌体释放出来后感染、裂解耻垢分枝杆菌，根据24h 内是否形成清晰的噬菌斑来判断是否存在结核分枝杆菌活菌，以及结核分枝杆菌是否耐药。该检测方法对检验人员技术水平和检测设备的要求均较低，且在24h 左右便可得出检测结果，具有较好临床应用前景。在采用噬菌体生物扩增法检测结核分枝杆菌时，若检测结果出现误差，可能与标本采集不当、患者感染的时间短、活性菌数量较少及噬菌体的浓度等存在一定的关系。

本研究的结果证实，采用涂片法、噬菌体生物扩增法对菌阴肺结核患者的支气管冲洗液进行检测的效果较佳，临床诊断价值较高，而用荧光定量PCR 法对此病患者的支气管冲洗液进行检测则存在一定的误差性。本研究也存在一定的不同之处，例如部分患者的遵医嘱性较差，影响其检测结果；样本量小，研究时间较短等。因此，在后期的研究中应加强与患者进行沟通，使其能够积极地配合研究与治疗，并延长研究时间，加大样本量，为菌阴肺结核的临床诊治提供更科学的数据。