骨疏灵的UPLC指纹图谱的建立及8种成分的含量测定

常红，袁腾腾，吕淑婕，王雷，2，陈卫东，2，张彩云*，桑冉（.安徽中医药大学药学院，合肥 23002；2.安徽省中药方剂重点实验室，合肥 23002；3.蚌埠医学院第一附属医院，安徽 蚌埠 233099；4.蚌埠医学院，安徽 蚌埠 233030）

骨质疏松症会导致骨脆性增加并容易发生骨折[1]。目前对于骨质疏松症的治疗主要包括服用抗骨吸收药物，如雌激素、双膦酸盐及降钙素和使用促进骨形成药物，如甲状旁腺激素。但长期服用会对机体产生损害，有研究表明，长期服用雌激素，乳腺癌、子宫内膜癌、心脏病及中风等疾病发生的风险会增加[2-3]。亦有长期服用双磷酸盐导致颌骨坏死等并发症发生的相关报道[4-5]。有些中药具有治疗骨质疏松症的作用，因不良反应少、疗效显著等特点，正逐渐被认可作为治疗骨质疏松症的一种重要的辅助和替代疗法[6]。

骨疏灵是安徽中医药大学第一附属医院的院内制剂（专利号：ZL200310112848.5），由淫羊藿、牛膝、黄芪和牡蛎4 味中药组成，临床上主要用于治疗和预防骨质疏松症，疗效确切且无明显不良反应[7-10]。中药成分复杂，指纹图谱具有整体性和模糊性，常作为中药质量评价和控制的分析方法[11-13]。基于此，本研究拟通过超高效液相色谱法（UPLC）建立骨疏灵的指纹图谱，并对其进行相似度评价和聚类分析，同时对指认出的有效成分进行含量测定，从定性和定量两个方面对骨疏灵进行评价，为其质量控制和药效物质基础研究提供参考。

1 材料

1.1 仪器

ACQUITY H-class 超高效液相色谱仪（美国沃特世公司）；Hei-VAP 旋转蒸发仪（德国海道尔夫公司）；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；JY502 型电子天平（上海浦春计量仪器有限公司）；AB135-S 型十万分之一电子天平（德国梅特勒-托利多公司）；Milli Q-Plus 超纯水系统（美国密理博公司）；WB-2000型数显恒温水浴锅（郑州长城科工贸有限公司）。

1.2 试药

色谱级乙腈（批号：SHBM1775，美国默克公司）；色谱级甲醇（批号：21110106G401，瑞典欧普森有限公司）；色谱级甲酸（批号：J2027129，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；超纯水（美国密理博公司），其他化学试剂均为分析纯。朝藿定A（批号：JOT-10354）、朝藿定B（批号：JOT-10353）（对照品，质量分数≥98%，成都普菲德生物技术有限公司）；毛蕊异黄酮（批号：MUST-18120901）、毛蕊异黄酮-7-O-葡萄糖苷（批号：MUST-19031920）、朝藿定C（批号：MUST-19081310）、蜕皮激素（批号：MUST-18120209）、淫羊藿苷（批号：MUST-18091010）、芒柄花苷（批号：MUST-19041101）（对照品，质量分数≥98%，成都曼思特生物科技有限公司）。原料药材的详细信息如表1 所示。经安徽中医药大学药学院俞年军教授鉴定，均符合2020年版《中国药典》标准。各饮片按处方比例随机组合，得到12 批骨疏灵样品（编号S1 ～S12），见表2。

表1 骨疏灵中各单味药饮片信息来源Tab 1 Source information of decoction piece of each ingredient of GSL

表2 12 批骨疏灵样品的药材组合Tab 2 Medicinal material combinations of 12 batches of GSL

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备 分别精密称定朝藿定A 2.93 mg、朝藿定B 3.47 mg、朝藿定C 3.26 mg、淫羊藿苷4.62 mg、芒柄花苷2.97 mg、毛蕊异黄酮2.01 mg、毛蕊异黄酮-7-O-葡萄糖苷2.07 mg、蜕皮激素1.07 mg，加甲醇溶解并定容至10 mL量瓶中，配制成单一对照品储备液。量取各单一对照品储备液适量，加甲醇配制成朝藿定A 29.3 μg·mL－1、朝藿定B 34.7 μg·mL－1、朝藿定C 32.6 μg·mL－1、淫羊藿苷46.2 μg·mL－1、芒柄花苷29.7 μg·mL－1、毛蕊异黄酮20.1 μg·mL－1、毛蕊异黄酮-7-O-葡萄糖苷20.7 μg·mL－1、蜕皮激素10.7 μg·mL－1的混合对照品溶液，备用。

2.1.2 供试品溶液的制备[14]取淫羊藿饮片15 g，黄芪饮片20 g，牛膝饮片12 g，牡蛎饮片8 g。淫羊藿与牛膝中加入8 倍量的（第1 次多加3 倍量）70%乙醇，回流提取3 次，每次2 h；黄芪与牡蛎中加入8 倍量的（第1 次多加1.5 倍量）水，煎煮2次，每次1 h。通过旋转蒸发仪将乙醇提取液回收乙醇后与水提液合并，浓缩至生药质量浓度为1.0 g·mL－1。取适量骨疏灵样品溶液用甲醇稀释，使生药质量浓度为0.1 g·mL－1，取上清液，0.22 µm滤膜过滤，取续滤液，备用。单味药制备方法相同。

2.2 色谱条件

采用ACQUITY H-class 超高效液相色谱仪系统，色谱柱为ACQUITY UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）；柱温35℃；流速0.15 mL·min－1；进样量2 μL；流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），洗脱梯度（见表3）；检测波长为260 nm。

表3 洗脱梯度程序Tab 3 Elution gradient

2.3 骨疏灵指纹图谱的建立

2.3.1 精密度试验 按照“2.1.2”项下操作制备骨疏灵供试品溶液（编号S5），连续进样6 次。以淫羊藿苷为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果其对应RSD分别小于0.31%和2.7%，表明该方法的精密度良好。

2.3.2 稳定性试验 取编号S5 的骨疏灵供试品溶液分别于室温下放置0、2、4、6、8、12、24 h，进样测定。以淫羊藿苷为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果其对应RSD分别小于0.27%和2.3%，表明供试品溶液在室温条件下放置24 h 稳定性良好。

2.3.3 重复性试验 取同一编号骨疏灵样品，按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液6 份，进样测定。以淫羊藿苷为参照峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果其对应RSD分别小于0.35%和2.8%，表明该方法的重复性良好。

2.3.4 指纹图谱的建立 制备12 批骨疏灵供试品溶液，进样测定，记录色谱图。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）》对色谱图进行分析，以S5 为参照图谱，时间窗的宽度设置为0.1 min，采用多点校正及全谱峰匹配生成UPLC 叠加指纹图谱（见图1），采用中位数法生成对照指纹图谱（见图2）。结果12 批骨疏灵供试品的指纹图谱中共标定了43 个共有峰。

图1 12 批骨疏灵样品叠加的UPLC 指纹图谱Fig 1 UPLC fingerprint of 12 batches of Gushuling samples superimposed

图2 骨疏灵的UPLC 对照指纹图谱Fig 2 UPLC control fingerprint of Gushuling

2.3.5 共有峰的指认 通过与混合对照品的色谱图比对，指认出8 个共有峰，即峰13 是毛蕊异黄酮-7-O-葡萄糖苷、峰16 是蜕皮激素、峰28是芒柄花苷、峰30 是毛蕊异黄酮、峰37 是朝藿定A、峰38 是朝藿定B、峰41 是朝藿定C、峰42 是淫羊藿苷。指认出的8 个共有峰占总共有峰峰面积比例为68.2%（见图3）。

图3 混合对照品和骨疏灵样品的UPLC 图Fig 3 UPLC of mixed reference（HB）and Gushuling sample

2.3.6 相似度评价 采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012 版）》对12 批骨疏灵样品进行相似度评价。结果12 批骨疏灵样品图谱与对照指纹图谱的相似度为0.9920 ～0.9960，表明不同批次样品间相似度较高，见表4。

表4 12 批骨疏灵样品的相似度评价结果Tab 4 Similarity evaluation of 12 batches of Gushuling samples

2.4 聚类分析

以12 批骨疏灵样品中8 种成分的峰面积为变量，使用SPSS 26.0 统计软件，采用离差平方和法以平方欧式距离为区间进行聚类分析，结果见图4。当平方欧氏距离为2 时，12 批样品可聚为三类，S4 聚为一类，S7 聚为一类，其余10 批聚为一类；当平方欧氏距离为3 时，12 批样品可聚为两类，S4 聚为一类，其余11 批聚为一类。

图4 12 批骨疏灵样品的聚类分析Fig 4 Cluster analysis of 12 batches of Gushuling samples

2.5 8 种有效成分的含量测定

2.5.1 专属性考察 取空白甲醇、混合对照品溶液和各样品溶液，进样测定，记录色谱图。结果毛蕊异黄酮-7-O-葡萄糖苷、蜕皮激素、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷色谱峰的分离度均良好，且阴性样品无干扰，见图5。

图5 骨疏灵样品中8 种成分专属性试验色谱图Fig 5 Chromatogram of 8 components in Gushuling samples for specific tests

2.5.2 线性关系考察 精密吸取单一对照品储备液用甲醇稀释，制成系列对照品溶液，进样测定，记录峰面积。以各化合物的质量浓度（X，µg·mL－1）为横坐标，峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归，结果见表5。

表5 线性关系考察结果Tab 5 Linearity

2.5.3 精密度试验 按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液（编号S5），连续进样6 次，记录峰面积。结果8种成分峰面积的RSD在0.12%～2.7%，表明仪器精密度良好。

2.5.4 稳定性试验 取编号S5 的骨疏灵供试品溶液分别于室温下放置0、2、4、6、8、12、24 h，进样测定，记录峰面积。结果8 种成分峰面积的RSD在0.25%～2.3%（n＝7），表明供试品溶液在室温条件下放置24 h 稳定性良好。

2.5.5 重复性试验 取同一批骨疏灵样品，按照“2.1.2”项下方法制备供试品溶液6 份，进样测定，记录峰面积。结果8 种成分峰面积的RSD在0.15%～2.8%，表明该方法的重复性良好。

2.5.6 加样回收试验 取已知含量的骨疏灵供试品（编号S5），分别精密加入与样品中各成分等量的单一对照品溶液（以甲醇为溶剂），进样测定，记录峰面积并计算加样回收率。结果毛蕊异黄酮-7-O-葡萄糖苷、蜕皮激素、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷的加样回收率分别为101.14%、96.04%、104.10%、96.73%、98.98%、98.06%、96.19%、96.93%，RSD分别为1.3%、4.0%、3.1%、1.8%、0.24%、0.88%、0.13%、0.22%。

2.5.7 样品含量测定 取12 批骨疏灵供试品溶液，进样测定，计算各成分含量，结果见表6。由表6 可知，朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷等成分含量较高，不同批次间的各个成分含量存在一定的差异，主要是由于原药材质量的影响。

表6 12 批骨疏灵供试品中8 种成分质量分数(mg·g－1)Tab 6 Content of 8 components in 12 batches of Gushuling (mg·g－1)

3 讨论

通过PDA 全波长扫描发现，朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷的最大吸收波长在270 nm，蜕皮激素的最大吸收波长在250 nm，毛蕊异黄酮-7-O-葡萄糖苷的最大吸收波长在260 nm，综合考虑整体化合物的最大吸收，最终选择260 nm 作为检测波长。

淫羊藿苷是淫羊藿的主要有效成分，其色谱峰的响应值相对较高，出峰时间适中，因此选择其为参照峰。本研究建立了12 批骨疏灵的UPLC 指纹图谱，与对照指纹图谱的相似度为0.9920～0.9960，说明12 批骨疏灵样品的质量稳定。

通过与对照品的色谱图进行比对，指认了12批骨疏灵中的8 个共有峰，包括来自于君药淫羊藿中的朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C 和淫羊藿苷，臣药牛膝的蜕皮激素，使药的主要有效成分毛蕊异黄酮-7-O-葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮，均为《中国药典》中单味药所规定的指标性成分。朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C 和淫羊藿苷能刺激成骨细胞的分化，其中淫羊藿苷的效果最显著[15]。蜕皮激素可通过抑制骨丢失和细胞凋亡以及诱导自噬，预防泼尼松诱导的大鼠骨质疏松症[16]。毛蕊异黄酮-7-O-葡萄糖苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮可通过增加内源性抗氧化剂发挥神经保护的作用[17]。因此，本研究选择这些成分作为考察骨疏灵质量的控制指标。

综上所述，本研究建立了骨疏灵的UPLC 指纹图谱和8 种主要成分的含量测定方法，可用于控制该方的质量。