云南弥勒甘蔗褐条病病原菌的分离鉴定

李 婕, 李银煳, 李庆红, 张荣跃, 王晓燕, 单红丽, 黄应昆*

(1. 云南省农业科学院甘蔗研究所, 云南省甘蔗遗传改良重点实验室, 开远 661699; 2. 云南省植保植检站, 昆明 650034)

甘蔗褐条病(sugarcane brown stripe disease)是我国蔗区常见的重要流行性真菌病害,它影响甘蔗叶片光合作用,从而影响糖分积累,发病严重时全株叶片受感染,叶片光合作用严重下降,植株矮小,严重感病时发病率高达80%以上,一般减产18%～35%,重的可达40%以上,蔗糖分降低15%～30%[1]。该病害于1924年在古巴首次发现[2-3],随后在美国、中国、印度、澳大利亚、巴西、斐济、日本、巴拿马、南非、巴基斯坦、泰国等多个植蔗国家均有不同程度的发生和危害报道,给当地蔗糖产业带来不同程度经济损失[4-7]。1975年,海南定安县甘蔗褐条病暴发流行,重病区发病率达100%,造成甘蔗矮小,减糖减产严重[8];1996年至1997年,云南弥勒蔗区大面积种植高感品种‘桂糖11号’,褐条病累计发病面积超过2 000 hm2,损失惨重[9];2001年,广西蒙山县褐条病发生流行,危害严重[10];2001年,云南临沧勐甘蔗区发生面积达2 800 hm2[11],2006年、2007年和2009年该病害进一步扩展到镇康、勐堆、云县、双江、耿马华侨等多个蔗区,最高病株率达100%[12],2009年发生面积达1 284.47 hm2,对当地蔗糖原料安全生产构成了严重威胁[13],该病害暴发流行给我国蔗糖产业造成了严重经济损失。

甘蔗褐条病在我国各蔗区普遍发生,已发展成为严重影响我国甘蔗产业高质量发展的重要常见病害,弄清其病原种类,有助于抗病品种筛选及病害的有效防控。国内外对甘蔗褐条病研究主要集中在发生情况调查和初步防治研究方面[14-17]。目前,已报道的甘蔗褐条病病原菌多为狭斑平脐蠕孢Bipolarisstenospila(=Helminthosporiumstenospilum)[1, 18]。云南省是我国第二大糖料基地,地处低纬高原,气候复杂多变。本研究以云南省弥勒甘蔗示范基地褐条病样为材料,进行病原菌的分离和鉴定,以期为该病害的有效防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

甘蔗褐条病样品于2019年采自云南省弥勒甘蔗示范基地高感品种‘云瑞10-187’和‘福农11-2907’,采集具有典型症状的甘蔗叶各3份,观察并记录病害症状。

1.2 病原菌分离和培养

采用组织分离法对病原菌进行分离,用灭菌剪刀在病健交界处截取大小约2 mm×2 mm的小块,依次浸泡于70%乙醇30 s、2%的NaClO 2 min,再用灭菌水冲洗3次,置于灭菌滤纸上晾干,最后置于PDA培养基上28℃恒温暗培养。3 d后长出白色菌丝,培养7 d后挑取单孢子在PDA培养基上进行纯化、保存。

1.3 形态学鉴定

取纯化后的菌株接种到PDA培养基中央,于28℃恒温暗培养7 d后,肉眼观察菌落形态特征,待其产孢后用解剖针挑取少许菌丝体制片,在显微镜下观察菌丝及分生孢子和孢子梗形态,并测量了50个分生孢子大小。

1.4 致病性测定

供试代表菌株BS1在PDA培养基上28℃生长7 d,然后将纯培养的病原菌用灭菌水洗下,倍比稀释浓度为1.0×106个/mL。接种品种为‘ROC22’,将孢子悬浮液喷于2个月大的健康甘蔗苗叶片上,套袋保湿24 h(相对湿度50%),28～30℃,自然光照。逐日观察记录发病情况。以喷灭菌水为对照。每个处理设置3个重复,每个重复1株。待其发病后,对接种发病的甘蔗叶片重新进行病原菌的再次分离及鉴定,观察其与原接种菌株性状是否一致。

1.5 病原菌分子生物学鉴定

病原菌总DNA按照真菌基因组DNA提取试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)说明书提取代表菌株BS1和BS2的基因组DNA。分别用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)进行ITS序列的PCR扩增[19],引物gpd1(5′-CAACGGCTTCGGTCGCATTG-3′)和gpd2(5′-GCCAAGCAGTTGGTTGTGC-3′)进行GAPDH序列的PCR扩增[20]。25 μL反应体系:ddH2O 8 μL，2×EasyTaqPCR SuperMix 12.5 μL, 10 μmol/L 上、下游引物各1 μL,DNA模板2.5 μL。ITS和GAPDH基因PCR扩增程序均为:94℃预变性3 min;94℃变性30 s,55℃退火45 s,72℃延伸45 s,35个循环;72℃延伸10 min。扩增产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测,将阳性PCR产物送北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序。测序结果首先在NCBI进行BLAST检索,与NCBI上已知序列进行同源比对,然后用MEGA 6.0软件进行序列分析,采用最大似然法(maximum likelihood)构建系统发育树,并进行1 000次的Bootstrap检验,从而确定其分类地位。

2 结果与分析

2.1 甘蔗褐条病田间症状观察

2019年10月发现云南省弥勒甘蔗示范基地‘云瑞10-187’和‘福农11-2907’高感甘蔗褐条病,发病率为50%～80%。病斑首先出现在幼叶上,最初症状为褪绿、椭圆形和水浸状小斑点,随着病害的发展,这些斑点沿主脉平行扩展为红色条纹,随后变长拉宽呈红褐色条纹,有些病变周围有黄色晕圈,成熟的条纹一般长5～25 mm,也可长达50～75 mm,宽2～4 mm(图1 a)。发病严重时,病斑合并连接形成宽带长条状红褐色病斑,最后病叶提早干枯。

图1 甘蔗褐条病症状及病原菌形态Fig.1 Symptoms and pathogenic morphology of sugarcane brown stripe disease

2.2 病原菌分离、培养及形态学鉴定

共分离获得6个菌株,在PDA上菌落均为圆形,初期呈白色,后逐渐变成灰绿色,菌丝密集(图1c)。培养7 d后,光学显微镜下进行形态学观察,分生孢子梗浅棕色,有隔,稍弯曲或直,单生或丛生,宽(3.5～5.2) μm,上部弯曲。分生孢子直至稍弯,纺锤形至梭形,浅棕色或棕色,4～10个横隔,大小为(31.7～96.7) μm×(10.7～16.3) μm,脐不明显或稍突起(图1e～1h)。初步将其鉴定为平脐蠕孢属Bipolaris。

2.3 致病性测定

接种菌株BS1孢子悬浮液3 d后,所有接种植株幼叶出现水浸状斑点,10 d后这些斑点变为红褐色条纹(图1 b),而对照仍无症状。从接种蔗叶中再次分离到与接种菌株相同的菌株,但未从对照中分离到。根据柯赫氏法则,进一步确定菌株BS1为甘蔗褐条病病原菌。

2.4 分子生物学鉴定

PCR扩增ITS和GAPDH基因均得到600 bp左右的清晰条带。代表菌株BS1和BS2测序序列BLAST同源性比对结果显示,ITS序列(登录号:MW466590、MW466591)与狗尾草平脐蠕孢Bipolarissetariae模式菌株CBS 141.31(登录号:EF452444)相似性达99.47%,与菌株CBSHN01(登录号:GU290228)相似性达100%;GAPDH序列(登录号:MW473721、MW473722)与狗尾草平脐蠕孢模式菌株CBS 141.31(登录号:EF513206)相似性达99.83%,与菌株CPC28802(登录号:MF490833)相似性达100%。基于ITS和GAPDH基因序列构建系统发育树,发现菌株BS1和BS2与狗尾草平脐蠕孢处于同一分支,亲缘关系最近(图2)。根据形态学和分子生物学鉴定结果将该病原真菌鉴定为狗尾草平脐蠕孢。

图2 基于ITS(a)和GAPDH(b)基因序列构建菌株BS1和BS2及其相关菌株的系统发育树Fig.2 Phylogenetic tree of strains BS1 and BS2 and the related strains based on ITS (a) and GAPDH (b) gene sequences

3 讨论

平脐蠕孢属真菌是重要的植物病原菌,可引起多种植物,尤其是禾本科作物及杂草叶斑、叶枯和根腐,造成重大经济损失,严重影响农业生产[20-21]。狭斑平脐蠕孢引起的褐条病是甘蔗叶片上的常见病害,它影响甘蔗叶片光合作用,从而影响糖分积累[1]。

近年来研究发现,甘蔗褐条病病原不止狭斑平脐蠕孢一种,钱双宏等[17]在海南甘蔗褐条病样品上分离到菌株HT-4,结合形态及ITS序列将其鉴定为平脐蠕孢属Bipolaris。Manamgoda等[22-23]和Bhunjun等[24]研究表明ITS、GAPDH和翻译延长因子1α基因(translation elongation factor 1-alpha,TEF-1α)适合鉴定区分平脐蠕孢属不同种,其中GAPDH基因为最佳标记,他们结合形态学和这些基因分别对平脐蠕孢属不同种进行了分子系统发育研究及种的描述鉴定,为甘蔗褐条病病原鉴定奠定了坚实的基础。目前,仅有Raza等[25]结合形态及分子鉴定,在广西、广东甘蔗叶片病斑上发现狗尾草平脐蠕孢。本研究于2019年田间调查发现‘云瑞10-187’和‘福农11-2907’高感褐条病,病株率为50%～80%,结合形态特征、多基因分子鉴定及致病性测定,在云南首次报道了狗尾草平脐蠕孢为甘蔗褐条病病原菌。研究结果丰富了甘蔗褐条病病原菌信息,为后续其他蔗区褐条病的研究奠定了基础。

多年来田间调查发现,甘蔗褐条病在不同品种不同蔗区发病症状略有差异,有的病斑为橘红色条纹,有的病斑为红褐色条纹,有些带有黄色晕圈,有些病斑细小,目前我国尚未对其病原种类及其多样性进行系统深入研究。狭斑平脐蠕孢和狗尾草平脐蠕孢在形态上的差异主要表现为,狭斑平脐蠕孢分生孢子梗上部偶尔膝曲,通常基部膨胀,分生孢子弯曲、少数直,倒棍状,3～12个横隔,脐不明显[18,25]。而狗尾草平脐蠕孢分生孢子梗基部不膨胀,分生孢子直或稍弯,纺锤形至梭形,4～10个横隔,脐不明显或稍突起。国内外研究表明,防治甘蔗褐条病最经济、安全、有效的方法就是培育和推广抗病品种[7, 26-28],因此明确甘蔗褐条病病原种类有助于今后筛选抗褐条病甘蔗品种,有助于该病害的科学防控。云南蔗区地处低纬高原,地理位置特殊,地形地貌复杂,甘蔗有害生物种类丰富多样,在这种复杂的生态环境下,我国甘蔗褐条病病原种类有哪些,优势种分布、致病力及其变异情况等尚不明确,亟须开展相关基础研究工作。