程序性死亡［蛋白］-1抑制剂诱导小鼠心肌炎模型的建立

陈怡帆，程蕾蕾，沈毅辉，张 卉，汪雪君，许宇辰，葛均波

1.复旦大学附属中山医院心内科，上海 200032；

2.上海市心血管病研究所，上海 200032；

3.国家放射与治疗临床医学研究中心，上海 200032；

4.复旦大学附属中山医院心脏超声诊断科，上海 200032

免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitor，ICI）已成为恶性肿瘤治疗的新热点［1］，但也诱发了以ICI相关心肌炎（ICIassociated myocarditis，ICIAM）为代表的免疫相关不良反应［2］，其发生率虽仅为0.21%～3.30%，但死亡率却高达27.0%～67.0%，居免疫相关不良反应之首［2-4］。程序性死亡 ［蛋白］-1（programmed death-1，PD-1）抑制剂是应用最广的ICI，其诱发的ICIAM已成为肿瘤治疗不可忽视的问题［5］，亟待通过动物模型探究治疗靶点。既往的小鼠心肌炎症损伤模型均存在成模率低、病变范围小、造模方式与临床治疗方案差异大等问题［6-10］，尚未有成熟的PD-1抑制剂诱导的自身免疫性心肌炎模型。因此，本实验拟建立一种能模拟PD-1抑制剂诱导的自身免疫性心肌炎发病过程的小鼠模型，为其机制研究及药物筛选评价奠定基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物

30只6周龄健康雄性BALB/c小鼠，体重（22.5f 2.5）g（南京卡莱斯生物科技有限公司，生产许可证号：320114000129353）。本实验经复旦大学附属中山医院伦理委员会批准，实验操作符合3R原则。

1.2 动物分组及模型建立

30 只小鼠编号并随机分为3 组：对照组（control组）、自身免疫性心肌炎组（TnⅠ组）和ICI相关心肌炎组（TnⅠ+anti-PD-1组），每组10只。除control组外，分别于第1、7天给小鼠皮下注射0.1 mL含有0.25 mg小鼠TnⅠ［生工生物工程（上海）股份有限公司，设计序列：HARVDKVDEERYDVEAKVTKNITEIADLTQKI YDLRGKFKRPTLRRVRIS］肽段的完全弗氏佐剂（美国Sigma公司）。TnⅠ+anti-PD-1组自第7天起，按每次5 mg/kg给予腹腔注射PD-1抑制剂（InVivoMab anti-mouse PD-1），每2 d给药1次，共5次，累积剂量为25 mg/kg。Control组每次给予与TnⅠ+anti-PD-1组同等剂量的生理盐水腹腔注射。本研究使用的TnⅠ（0.25 mg）和anti-PD-1剂量（每次5 mg/kg）是基于已发表的研究［7，11］。各组于造模第1、21、56天检测心脏功能和分子水平变化。

1.3 一般状态

造模前：分别给小鼠称重。造模后：记录小鼠每日进食量，观察其一般情况变化，记录死亡情况。

1.4 心脏指数

第56天将小鼠全部处死，开胸，沿主动脉根部游离出心脏，用手术剪将大血管残端、筋膜和脂肪组织剔除，分离出全心，灌注预先配制好的磷酸盐缓冲盐溶液（phosphate-buffered saline，PBS）冲去残留血液，滤纸吸水，分析天平称量全心湿质量，计算心脏指数（cardiac index）：心脏指数=全心湿质量（mg）/小鼠体重（g）。

1.5 二维超声心动图

第1、56天用Vevo2100超声系统（加拿大Visual Sonics公司）进行二维超声心动图检查，采用30 MHz高频扫描探头采集图像。小鼠吸入异氟烷麻醉后平卧，胸前区备皮。在胸骨旁左室长轴切面左室内径最大处显示M型图像，连续采集15 s，分析左心室射血分数（ejection fraction，EF）。

1.6 病理学检查

第56天将小鼠处死后，小鼠心脏用10%多聚甲醛溶液固定24 h，用石蜡包埋，然后制成厚5 μm的水平切片。用H-E染色，选取光镜下的代表性图像（放大40倍）进行分析。出现以下病理学特征之一可被判定为发生心肌炎：急性心肌炎期，心外膜下及心肌间质弥漫性炎症细胞浸润，心肌细胞坏死和间质水肿［12］；扩张型心肌病期，心肌细胞边界模糊、纤维紊乱，细胞核排列不规则，部分细胞核固缩、碎裂，心肌间质空泡样改变［13］。

小鼠肺、肝脏、肾脏、小肠分别用10%多聚甲醛溶液固定24 h，用石蜡包埋，然后制成5 μm厚的水平切片。分别进行H-E、Masson染色并选取光镜下的代表性图像（放大40倍）进行分析。出现以下病理学特征之一可被判定为发生TnⅠ、PD-1对其他器官的损害：出现弥漫性炎症细胞浸润，间质水肿、空泡样改变、纤维化增加，细胞坏死和细胞核固缩、碎裂［13］。

1.7 血清生物标志物

第56天眼眶取500～1000 μL血液，2000hg离心20 min，取上清液300 μL，24 h内用酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（武汉云克隆科技股份有限公司，SEA109Mu，MEA479Mu）检测血清肌酸激酶（creatine kinase，CK）和CK同工酶（CK isoenzyme，CK-MB）。

1.8 统计学处理

所有数据均用xfs表示。多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），使用Graphpad Prism 8.0软件进行Turkey法检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

造模前control组、TnⅠ组和TnⅠ+anti-PD-1组小鼠体重分别为（22.4f 1.6）、（21.8f 1.8）和（22.4f 1.2）g，各组间差异无统计学意义（P＞0.05）；造模第21、56天，与control组相比，TnⅠ组和TnⅠ+anti-PD-1组的体质量均显著下降 ［第21天：（22.8f 1.5）gvs（19.5f 1.2）和（18.7f 1.0）g，P均＜0.05；第56天：（22.7f 1.4）gvs（19.0f 1.3）和（17.1f 0.4）g，P均＜0.01］，且TnⅠ+anti-PD-1组较TnⅠ组的体质量也显著下降 ［第21天：（18.7f 1.0）gvs（19.5f 1.2）g，P＜0.05；第56 天：（17.1 f 0.4）gv s（19.5f 1.2）g，P＜0.05，图1A］。

造模开始后，与control组相比，TnⅠ组和TnⅠ+anti-PD-1组进食量均显著下降 ［第21天：（4.7f 0.2）gvs（4.0f 0.3）g，P＜0.05，（4.7f 0.2）gvs（3.5f 0.1）g，P＜0.01；第56天：（4.8f 0.2）gvs（3.4f 0.1）g，P＜0.05，（4.8f 0.2）gvs（2.4f 0.2）g，P＜0.01，图1 B］，伴精神状况差、活动强度减弱，TnⅠ+anti-PD-1组更严重。Control组至第56天均无小鼠死亡；TnⅠ组至第21天无小鼠死亡，死亡率为0%，与control组相比，差异无统计学意义（P＞0.05），第56天累计1只死亡，死亡率为10%，与control组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。TnⅠ+anti-PD-1组第21天累计1只死亡，死亡率为10%，第56天累计2只死亡，死亡率为20%，与control组相比，差异均有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01，图1C）。

2.2 心脏指数

第56天将小鼠全部处死，分离全心并称量心脏湿质量，计算各组心脏指数。第56天，与control组相比，TnⅠ组的心脏指数未显著增加［（4.6f 0.2）mg/gvs（4.4f 0.2）mg/g，P＞ 0.05］，而TnⅠ+anti-PD-1组的心脏指数显著增加 ［（5.4f 0.1）mg/gvs（4.4f 0.2）mg/g，P＜0.05，图1D］。

图1 小鼠一般状态、死亡率及心脏指数Fig.1 General status,mortality and cardiac index of mice

2.3 二维超声心动图

采用Vevo2100超声系统对小鼠进行二维超声心动图检查。图2A为造模第56天扩张型心肌病期典型M型超声图像。与control组相比，TnⅠ+anti-PD-1组的左心室EF显著下降（45.3%f 5.2%vs63.7%f 4.6%，P＜0.001），且较TnⅠ组下降更显著（58.6%f 2.8%vs63.7%f 4.6%，P＜0.01，图2B）。

图2 扩张型心肌病期典型M型超声心动图图像及左心室EFFig.2 Typical M-mode echocardiographic images and left ventricular EF during dilated cardiomyopathy stage

2.4 心肌病理学改变

造模第21、56天分别取小鼠心脏以多聚甲醛溶液固定、石蜡包埋、切片行H-E染色。每组1只小鼠的典型病理学切片如图3所示。

第21天急性心肌炎期：control组心肌细胞排列整齐、组织致密，该组10只小鼠均具有此特征；TnⅠ组见心外膜下少量炎症细胞浸润，细胞形态结构尚完整，该组9只小鼠具有此特征；TnⅠ+anti-PD-1组心外膜下大量炎症细胞浸润，细胞边界不清、坏死，间质水肿形成，该组10只小鼠均具有此特征，死亡的1只小鼠病理学改变最典型（图3）。

图3 心肌H-E染色Fig.3 H-E staining of myocardium

第56天扩张型心肌病期H-E染色：control组心肌细胞仍排列整齐、形态正常，该组10只小鼠均具有此特征；TnⅠ组较第21天，浸润的急性炎症细胞明显减少，但心肌细胞有轻度边界不清、间质空泡化，该组10只小鼠均具有此特征，死亡的1只小鼠该改变最典型；TnⅠ+anti-PD-1组急性炎症细胞浸润减少，但细胞边界不清、纤维紊乱、间质空泡化更显著，部分细胞核呈异形、多核、核固缩、碎裂等病理学改变，该组9只小鼠具有此特征，其中死亡的2只小鼠病理学改变更显著（图3）。

2.5 其他器官病理

造模第56天分别取小鼠肺、肝脏、肾脏、小肠，以多聚甲醛溶液固定、石蜡包埋、切片行H-E、Masson染色。每组1只小鼠的典型病理学切片如图4所示。Control组和TnⅠ+anti-PD-1组肺、肝脏、肾脏、小肠的细胞排列规则、形态基本正常，无明显炎症细胞浸润和间质水肿、纤维化增加，无明显细胞坏死及细胞核固缩、碎裂，control组和TnⅠ+anti-PD-1组的10只小鼠均具有以上特征。H-E染色下，TnⅠ组肺、肝脏、肾脏、小肠则出现不同程度的炎症细胞浸润，细胞排列及形态紊乱，相比于以上两组，出现明显间质水肿、空泡样改变，以及细胞坏死和核固缩、碎裂；Masson染色下，各器官出现较明显的纤维增生性改变，TnⅠ组的10只小鼠均具有以上特征。

图4 其他器官H-E和Masson染色Fig.4 H-E and Masson staining of myocardium

2.6 血清生物标志物

第56天各组小鼠眼眶取血，2000×g离心20 min，取上清液检测CK和CK-MB水平。与control组相比，TnⅠ+anti-PD-1组小鼠血清CK和CK-MB显著升高 ［CK：（2833.0f 115.7）U/Lvs（1025.0f 74.8）U/L；CK-MB：（86.4f 2.6）U/ Lvs（40.3f 3.5）U/L，P均＜0.001］，且较TnⅠ组升高更显著 ［CK：（2833.0f 115.7）U/Lvs（1578.0f 99.7）U/ L，P＜0.01；CK-MB：（86.4f 2.6）U/Lvs（58.8f 5.6）U/L，P＜0.05，图5］。

图5 血清生物标志物Fig.5 Serum biomarkers

3 讨论

防治PD-1抑制剂诱发的ICIAM是免疫治疗的热点［14］，小鼠模型具有简单、经济、重复性高的特点。因此，建立模拟PD-1抑制剂诱导心肌炎发病的小鼠模型，是促进其机制研究及药物筛选评价的有效方法。

目前已有小鼠自身免疫性心肌炎模型和PD-1抑制剂诱导的心肌损伤模型。其中，第一种多以重组肌球蛋白重链-α诱导［9］、直接细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（cytotoxic T lymphocyte associated antigen-4，CTLA-4）和PD-1基因敲除［15］、柯萨奇病毒感染［16］构建，但其大多只能建成急性心肌炎模型，未能模拟出慢性期心脏扩张、纤维结构紊乱等特点，成模率不足60%，心肌病变范围仅15%～40%，甚至有脾脏、胰腺等免疫反应强于心脏本身的情况［15］，且成本高、重复性差、与临床PD-1抑制剂给药方法差异大［9，11，15］，这些均极大地干扰了模型的有效性评估。第二种虽成模率能达到70%～90%，但通常需与程序性死亡［蛋白］配体-1（programmed death ligand-1，PD-L1）抑制剂联合、短时间大剂量给药（6～10 d，每天各5～10 mg/kg），难以反映真实的ICIAM用药和发病过程，其心肌损伤程度较第一种模型更轻，心肌病变面积仅为10%～20%，血清心肌酶波动常无显著差异［7，17］，与部分患者能由PD-1抑制剂诱发3～4级免疫性心肌炎差距大。综上，这两种模型均不是模拟人类ICIAM发病过程及特点的理想模型。

PD-1抑制剂多以每2 d给药5～10 mg/kg以模拟临床治疗方案，但其累积剂量超过30 mg/kg时小鼠急性炎症期的死亡率高达40%，且造成广泛的肺、肠、肾、肝等靶器官外急性炎症浸润，严重影响造模成功率［7，18］。TnⅠ是引起ICIAM的主要自身免疫反应抗原，有研究［11］曾以2次0.25 mg TnⅠ皮下注射构建自身免疫性心肌炎模型。构建小鼠TnⅠ肽段诱导自身免疫性心肌炎，再以PD-1抑制剂强化，有望增加成模率，减少靶器官外损伤。因此，本实验采用的造模方案为：每次5 mg/kg腹腔注射PD-1抑制剂，每2 d给药1次，共持续5次，累积剂量25 mg/kg，同时辅以2次0.25 mg TnⅠ诱导，既可以使小鼠生物学变化更接近患者的真实情况，又可以避免短时大量给药而增加死亡率。小鼠体重、进食和死亡率是评价其一般状态和造模成功率的重要指标［19］，TnⅠ+anti-PD-1组在急、慢性心肌炎期体重和进食情况下降更显著，提示在TnⅠ诱发自身免疫心脏损伤的同时，ICI更加重了此损伤，与小鼠死亡率随anti-PD-1累积剂量增加而上升的趋势相近。尽管如此，本方法anti-PD-1组小鼠死亡率仍不高于20%，保证了造模成功率。

左心室EF是心功能评估较重要的指标之一，有研究［20］报道，PD-1抑制剂诱发ICIAM致左心室EF下降。TnⅠ+anti-PD-1组左室EF下降较TnⅠ组更显著，提示PD-1抑制剂不仅能在有TnⅠ等心肌炎诱发基础的环境下诱导ICIAM，更可能下调免疫负反馈通路，加重炎症和心肌损伤。心脏指数的变化也为此提供了佐证，心脏指数能直接反映心肌增生肥厚并间接提示心室重构、左心功能不全［21］。TnⅠ组该指数无显著增加，而TnⅠ+anti-PD-1组则显著增加，进一步证明了联用TnⅠ和anti-PD-1能造成更典型的自身免疫性心肌损伤。

H-E染色是评估心肌细胞形态变化、判断炎症细胞浸润的重要手段［22］。既往自身免疫性心肌炎模型以心肌坏死、间质水肿、小簇状单核细胞和CD62L-CD4+T细胞、CD3+CD8+T细胞、CD68+巨噬细胞的浸润为特征，未见明显心肌纤维化［8-9］。PD-1抑制剂诱导的心肌损伤模型也仅见4%～8%的间质性心肌纤维化［7，10］。本研究模型的心肌病理学改变与上述两种模型差异较大，除能观察到大量急性炎症细胞浸润，还能继续随访慢性扩张型心肌病期的特点，TnⅠ+anti-PD-1组无论急、慢性心肌炎期细胞形态异常都最显著，尤其是出现心肌纤维紊乱、空泡化等慢性特征性改变。CK和CK-MB在心肌损伤的全程中都可维持较高水平［23］。本研究模型在慢性期仍有明显的CK和CK-MB升高，提示联合用药造成显著而长期的心肌损伤，这是既往模型不具备的，突出了本研究模型的长期稳定性和有效性。

本研究探索出一种全新的、效果良好的小鼠自身免疫心肌炎模型的构建方法。通过给予小鼠腹腔注射PD-1抑制剂和皮下注射经特殊设计的小鼠TnⅠ肽段来构建模型，并确定了合理而成熟的剂量和给药间隔，有效地提高了建模的成功率和稳健性，且方法简单易行，便于推广。同时，也为ICIAM发病机制研究、治疗药物筛选、药物疗效评价提供了经济实用的实验对象。

本研究模型仍存在一定的局限性。首先，剂量关系上，不同的单次给药和累积给药剂量对各评价指标的影响需进一步探索，以模拟临床PD-1抑制剂多种治疗方案的心肌损伤效果。其次，时间关系上，指标采集点时间间隔较长，可设置更多采集点，以评估各指标随时间推移的动态的变化趋势。

本实验建立了一种PD-1抑制剂诱导的、低死亡率的小鼠心肌炎模型，以心肌急慢性自身免疫炎性改变、左心室EF下降、心肌酶谱升高为突出特征。同时，设计合成了一种特殊的小鼠心肌TnⅠ肽段，强化了PD-1抑制剂的造模效果。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。