尼莫地平注射液细菌内毒素检查法的探讨

刘艳平，张秀花

（菏泽市食品药品检验检测研究院，山东 菏泽 274032）

尼莫地平注射液为钙离子拮抗剂，具有抗缺血和抗血管收缩作用[1]，2005年首次载入《中国药典》，现行质量标准检查项下仍保留热原检查项目[2]。尼莫地平注射液进行热原试验时，经常引起试验兔体温异常下降现象，必须反复重试，消耗大量人力、物力[3]，且易导致试验结果假阴性，临床用药存在较大的安全隐患。近年，关于尼莫地平注射液细菌内毒素检查方法的研究甚少。凝胶法为细菌内毒素检查的经典方法，操作简单，灵敏度高，干扰因素少，结果重现性好，替代热原检查法成为必然。

1 仪器与材料

1.1 仪器

TAL-40D型试管恒温仪（湛江安度斯生物有限公司）；ZH-2型自动漩涡混合器（天津药典标准仪器厂）；可调微量移液器（规格：20～200 μl，100～1000 μl，赛默飞）。

1.2 材料

鲎试剂[TAL，湛江安度斯生物有限公司，批号：1908012，灵敏度（λ）为0.125 EU/ml；批号1907081，λ为0.25 EU/ml；规格均为0.1 ml/支]；TAL（福州新北生化工业有限公司，批号：19090812，λ为0.125 EU/ml；批号：19061612，λ为0.25 EU/ml；规格均为0.1 ml/支）；细菌内毒素工作标准品（CSE，中国食品药品检定研究院，批号：150601-202088，规格：60 EU/支）；细菌内毒素检查用水（BET水，厦门鲎试剂生物科技股份有限公司，批号：1912241，规格：10 ml/支）；尼莫地平注射液（批号：2012196，20041164，200616，规格：100 ml:20 mg，均由委托单位提供）。无热原吸头（湛江安度斯生物有限公司，批号：1912241，规格：250 μl；批号：2001063，规格：1000 μl）。

2 方法与结果

2.1 TAL λ复核

取TAL 4批，每批18支，分别加BET水0.1 ml溶解；取CSE 1支，用1.0 ml BET水溶解后，在旋涡混合器上混匀15 min，制备2λ、λ、0.5λ、0.25λ4个浓度的内毒素标准溶液。取不同浓度的内毒素标准溶液，分别与等体积的鲎试剂溶液混合，每一内毒素浓度平行做4管；其余2管加入等体积的BET水作为阴性对照，依法检查[4]，并计算TAL灵敏度测定值（λc）。结果见表1。

表1 TALλ复核试验结果

由表1可知，λc均在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）范围内，表明复核结果符合规定，4批鲎试剂均可用于细菌内毒素检查。

2.2 细菌内毒素限值（L）确定

根据公式L=K/M[4]，注射剂K=5 EU/(kg·h)；M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，临床用量为100 ml，qd，人均体重按60 kg计算，则L=5/(100/60)=3 EU/ml。根据注射剂安全性检查法应用指导原则[4]，为确保临床用药安全，本试验细菌内毒素限值设定至计算值的1/3，即1 EU/ml。

2.3 最大有效稀释倍数（MVD）确定

目前市售TALλ一般在0.5～0.03 EU/ml之间，最大有效稀释倍数MVD=CL/λ，其中C为供试品溶液的浓度，C=1.0 ml/ml。经计算，MVD分别为2，4，8，16，32倍。

2.4 干扰预实验

取TAL 2批，每批34支，分别加BET水0.1 ml溶解。取尼莫地平注射液3批，分别用BET水稀释2，4，8，16，32倍，每个浓度2管，标记为供试品阴性对照（NPC）系列。取CSE 1支，用BET水1.0 ml溶解，在旋涡混合器上混匀15 min后，用上述NPC系列作稀释剂，制备2λ供试品溶液，每个浓度2管，标记为供试品阳性对照（PPC）系列，同时设置细菌内毒素阳性对照（PC）和BET水阴性对照（NC），每个系列各2管，依法检查，结果见表2。

表2 尼莫地平注射液干扰预实验结果

由表2可知，NC均为阴性，PC均为阳性，试验有效。NPC均为阴性，8倍稀释液对TAL均无干扰作用。

2.5 正式干扰试验

取TAL 2批，每批66支，分别加BET水0.1 ml溶解。取尼莫地平注射液3批，分别用BET水稀释8倍。取CSE 1支，分别用BET水和8倍稀释液制成2λ、λ、0.5λ、0.25λ的BET水系列和供试液系列，每一浓度4管；其余2管加BET水作阴性对照，依法检查，分别计算反应终点浓度的几何平均值Es、Et。结果见表3。

表3 尼莫地平注射液干扰试验结果

由表3可知，Es均在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）之间，且Et均在0.5Es～2Es（包括0.5Es和2Es）之间，试验结果符合细菌内毒素检查有效性的规定，说明供试品在该浓度下无干扰作用[5]。

2.6 细菌内毒素检查

根据干扰试验结果，取供试品3批，用BET水稀释8倍后，分别采用两个厂家λ均为0.125 EU/ml的TAL依法检查，结果见表4。

表4 尼莫地平注射液细菌内毒素检查结果

由表4可知，PC均为阳性，NC均为阴性，PPC均为阳性，试验有效。供试品管均为阴性，表明3批样品细菌内毒素检查结果均符合规定[4]。

3 讨论

尼莫地平注射液为几乎无色的澄明液体，标准规定pH值为5.5～7.5[2]。鲎试剂最适反应pH值为6.0～8.0，过酸或过碱会对试验起干扰作用[6]。经测定，本品pH值为6.6，不需要进行酸碱性调节，稀释法可用于细菌内毒素检查。

干扰试验的目的是确定供试品在多大的稀释倍数或浓度下对内毒素和TAL的反应不存在干扰作用，可以使用较低灵敏度的TAL进行干扰试验的预实验，正式干扰试验时，应尽量选择不干扰稀释倍数或浓度对应灵敏度的TAL进行试验[5]。由表2可见，稀释倍数相同的样品，对TAL的干扰作用不同。4倍稀释液对一批TAL有干扰作用，而对另一批TAL无干扰作用，8倍稀释液对两批TAL均无干扰作用。MVD为8倍时对应TAL的灵敏度为0.125 EU/ml，故本试验选用灵敏度为0.125 EU/ml的鲎试TAL剂进行正式干扰试验，结果符合要求。

热原检查法检验周期长，干扰因素多，检验成本高，终将被细菌内毒素检查法替代。细菌内毒素检查法是药品检验中应用十分广泛的一项检测技术，被世界各国药典所收载[7-8]。细菌内毒素检查法代替热原检查法已应用于500多种药品或原料药[9]。本试验结果表明，尼莫地平注射液用BET水稀释8倍时，对灵敏度≥0.125 EU/ml的鲎试剂无干扰作用，采用L为1.0 EU/ml进行细菌内毒素检查是可行的，可用于原料及制剂的质量控制。