女贞子制备红景天苷的工艺研究

杨阳，刘凯华，潘朝，张良明，李超敏

（西安天一生物技术股份有限公司，陕西西安 710000）

女贞子为木犀科植物女贞的干燥成熟果实，味甘苦、性凉，归肝经和肾经，具有补益肝肾、滋阴清热、凉血明目等功效[1]。含有三萜类（齐墩果酸等）、环烯醚萜类（女贞苷、女贞子苷、橄榄苦苷等）、苯乙醇类（红景天苷、北升麻宁等）、黄酮类等化合物及丰富的挥发油、脂肪酸、糖类、氨基酸、微量元素和甾醇类等多种活性成分[2]。女贞在我国分布广泛，用女贞子提取红景天苷比起资源贫乏的红景天获取更加容易且价格低[3]。本文以女贞子为原料，经水提取后盐酸水解环烯醚萜类物质，通过单因素实验，确定提取、水解方法及树脂纯化选型等以提高红景天苷含量。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

LC-20AT液相色谱仪，日本岛津；SPD-20A检测器，LabSolutions化学工作站；SQP电子天平，北京赛多利斯科学仪器有限公司；RE-52A旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；SHZ-D（Ⅲ）循环水式多用真空泵，天津华鑫仪器厂；DZTW调温电热套，上海科恒实业发展有限公司；BO-150T粉碎机，永康铂欧高速多功能粉碎机。

红景天苷对照品，批号110818-202009，中国食品药品检定研究院；AB-8大孔树脂，西安蓝晓科技新材料股份有限公司；甲醇为色谱纯，蒸馏水、超纯水，自制；其他所用试剂和溶剂均为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 高效液相色谱法测定

（1）色谱条件。色谱柱：岛津Shim-pack VP-ODS（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：15%甲醇水溶液；检测波长为275 nm；流速：1 mL/min，进样量10 μL[4]。

（2）对照品溶液的制备。精确称取红景天苷对照品5.07 mg，加甲醇制成0.5 mg/mL的溶液，即得。

（3）线性关系。精密量取红景天苷对照品溶液2 μL、4 μL、6 μL、8 μL和10 μL，注入液相色谱仪。按1.2.1（1）项下色谱条件进行分析，以浓度X为横坐标，峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程为Y=654 580X+5 099.2，R2=0.999，表明红景天苷在0.1～0.5 mg/mL范围内线性关系良好。

（4）供试品溶液制备。提取液：取一定体积液体，滤过，取续滤液，稀释至适当浓度即得。提取物：精密称取女贞子提取物20 mg，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10 mL，密塞，称定重量，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

1.2.2 提取方法

女贞子原料经粉碎机粉碎后通过国家标准的R40/3系列下二号筛，准确称取一定量置于锥形瓶中，按下列方式提取。

（1）提取溶剂分别为60%乙醇、75%乙醇、90%乙醇、水，料液比（mL∶g）为25∶1，提取时间为2 h。（2）提取溶剂为水，料液比（mL∶g）分别为7∶1、15∶1、25∶1，提取时间为2 h。（3）提取溶剂为水，料液比（mL∶g）为25∶1，提取时间分别为1 h、2 h、3 h。

单因素点提取液过滤，醇液需浓缩至无醇，分别加2%（原料质量）盐酸（质量分数为36%），在85 ℃水浴中水解1 h，然后用NaOH调至中性，待冷却至常温后，记体积备用，按1.2.1（1）中色谱条件检测其浓度，计算女贞子中红景天苷得率，公式为：

式（1）中w表示红景天苷得率，%；c为红景天苷浓度，mg/mL；v为液体体积，mL；m为称取的女贞子质量，g。

分别对上述提取方法中的提取溶剂、液料比、提取时间3个影响因素进行单因素考察，确定最佳提取方法。

1.2.3 水解方法

准确量取一定体积的女贞子水提溶液置于锥形瓶中，按下列方式水解。

（1）水解温度分别为60 ℃、85 ℃、100 ℃，加入原料质量3%的盐酸，水解2 h。（2）水解温度为85 ℃，分别加入原料质量1%、2%、3%的盐酸，水解时间为1 h。（3）水解温度为85 ℃、加入原料质量3%的盐酸，水解时间分别为0.5 h、1.0 h和2.0 h。

单因素点分别用NaOH调至中性，待冷却至常温后，记体积备用，按1.2.1（1）中色谱条件检测其浓度，根据式（1），计算女贞子中红景天苷得率。分别对上述水解方法中的水解温度、盐酸加入量、水解时间3个影响因素进行单因素考察，确定最佳水解方法。

1.2.4 树脂纯化

（1）静态吸附确定上样量及上样pH值。准确量取一定体积女贞子提取水解中和液，置于250 mL具塞锥形瓶中，在不同pH值条件下，加入处理好的一定质量的大孔树脂，水浴锅振摇4 h，然后静置20 min，测定浓度。根据液体吸附前后浓度计算吸附量，确定最适上样树脂及上样pH值[5]。

（2）树脂上样原料质量的确定。准确称取100 g经粉碎机粉碎后通过国家标准的R40/3系列下二号筛的女贞子原料，根据最佳提取方法和水解方法，制备上样液。取100 g A8-8树脂装柱，提取液上柱，上样流速为1 BV/h，每240 mL收集1次，共收集6份，精确吸取每份各10 μL注入高效液相色谱，检测收集液红景天苷浓度，以红景天苷浓度和收集次数作泄露曲线，确定上样质量。

（3）洗脱溶剂的选择。取100 g原料制备样液以2 BV/h的流速通过装有AB-8大孔树脂的层析柱，然后用8 BV水、8 BV 10%乙醇、8 BV 20%乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥，检测含量，确定最佳洗脱溶剂[6]。

2 结果与分析

2.1 提取方法对红景天苷得率的影响

2.1.1 提取溶剂对得率的影响

提取溶剂对红景天苷得率的影响如图1所示。结果表明75%乙醇提取和生活用水提取相差不大，考虑到生产成本及后续盐酸水解，选择水作为提取溶剂。

图1 提取溶剂的考察

2.1.2 不同料液比对得率的影响

液料比对红景天苷得率的影响如图2所示，料液比从7∶1增大到15∶1，红景天苷得率上升，继续增大料液比得率变化不明显。从提取效率及经济角度选择15∶1（mL∶g）的料液比。

图2 料液比的考察

2.1.3 提取时间对得率的影响

提取时间对得率的影响如图3所示，结果表明提取时间为2 h时，能将大部分环烯醚萜类和红景天苷提取出来，因此选择提取时间为2 h。

图3 提取时间的考察

2.2 水解方法对红景天苷得率的影响

2.2.1 水解温度对得率的影响

水解温度对红景天苷得率的影响如图4所示，温度低水解不彻底，温度高可能使生成的苷元发生聚合反应，从而影响红景天苷含量，结果表明水解温度应选择85 ℃。

图4 水解温度的考察

2.2.2 盐酸加入量对得率的影响

盐酸加入量对得率的影响如图5所示，盐酸加入量少（1%）影响水解效果，加入多（3%）效果提升不明显，同时为了防止聚合反应的发生，选择加入原料质量2%的盐酸。

图5 盐酸加入量的考察

2.2.3 水解时间对得率的影响

水解时间对得率的影响如图6所示，结果表明环烯醚萜类化合物1 h即可完成水解，继续延长时间没有意义。

图6 水解时间的考察

2.3 树脂优选

通过吸附实验（表1）可知，AB-8和LX-32在pH=5时效果较好，当溶液pH上升到7和9，AB-8树脂的效果明显好于其他树脂。因此，选用AB-8树脂进行后续实验。

表1 pH值对4种型号大孔树脂静态吸附红景天苷的影响

AB-8动态吸附泄露曲线如图7所示，从第4份开始有明显泄露，因此100 g树脂能吸附720 mL提取液，即50 g原料。

图7 红景天苷泄露曲线

不同洗脱溶剂对红景天苷解析率的影响见表2。由表2可知10%乙醇能洗脱大量的红景天苷，因此选用10%乙醇作为洗脱溶剂。

表2 不同溶剂对红景天苷的洗脱效果

2.4 验证实验

通过单因素实验，得到提取最佳工艺条件为：在沸水回流提取前提下，料液比15∶1（mL∶g）、提取时间2 h、提取液过滤，加入2%（原料重量）盐酸、85 ℃水解1 h、然后用NaOH调至中性，静置、降至常温后过滤、AB-8树脂纯化、8 BV水洗杂质及8BV 10%乙醇洗脱，最后收集洗脱液，浓缩干燥即得女贞子提取物，由表3表明工艺稳定可行。

表3 验证实验结果

3 结论

本次工艺研究主要对女贞子制备红景天苷提取工艺进行了优化，经水提、盐酸水解、大孔树脂纯化后红景天苷的含量达到55%以上，且解析率为90%。工艺稳定且操作简便，对红景天苷市场供应不足问题提供一定的解决思路。