黄芩苷铜的优化合成及其对猪源大肠杆菌K88的抗菌作用

吴仲元 ， 师亚倩 ， 周华林 ， 曹晨晨 ， 邱银生

(1.武汉轻工大学动物科学与营养工程学院 ， 湖北 武汉 430023 ； 2.襄阳职业技术学院农学院 ， 湖北 襄阳 441050)

中药黄芩能有效防治猪败血症，清除猪血液内有毒物质，抑制菌血症的发生[1]。黄芩苷是黄芩的主要成分,是重要的黄酮类化合物。黄芩苷及其复方制剂已被广泛应用于养殖业，具有清热解毒、提高机体免疫力、抗炎抑菌、抗应激和改善生产性能等多种作用[2-3]。黄酮类化合物与金属离子形成配合物后抗菌活性明显增强，备受研究人员关注[4]。前期研究发现，黄芩苷金属配合物对革兰阳性菌、革兰阴性菌和真菌的抑制作用比黄芩苷更强[5-6]。

为制备抗菌效果好的黄芩苷铜配合物，本试验采用正交试验设计优化黄芩苷铜的合成工艺，并分析其对大肠杆菌(Escherichiacoli，E.coli)K88的不耐热肠毒素(Heat-labile enterotoxin，LT)的释放量和超微结构的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试验材料 黄芩苷(92%)，购自四川协力制药有限公司；黄芩苷标准品(93.5%，批号：110715-201619)，购自中国药品生物制品检定所；猪源大肠杆菌不耐热肠毒素(LT)试剂盒，购自上海蓝基有限公司；五水硫酸铜和碳酸氢钠，均购自天津市凯通化学试剂有限公司；乙腈、甲醇和磷酸(均为色谱纯)，均购自天津科密欧化学试剂有限公司；大肠杆菌K88，由动物营养与饲料科学湖北省重点实验室提供。

1.2 主要仪器 精密分析天平(BS 110S，北京赛多利斯仪器系统有限公司)；微型涡旋混合仪(FW 80，上海沪西分析仪器厂有限公司)；高效液相色谱仪(Waters，美国 Waters 公司)；掌上离心机(D1008E，SCI LOGEX 公司)；倒置荧光显微镜(Moticam 3000，MOTIC 公司)；原子吸收分光光度计(AAS-6000，江苏天瑞仪器股份有限公司)；微量移液器(Eppendorf 公司)；扫描电镜(Hitachi U8010，日本日立仪器有限公司)；多功能酶标仪(SpectraMax M2e 型，Molecular Devices 公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 正交试验设计优化黄芩苷铜的合成工艺条件 根据单因素试验结果，选取反应时间(A)、反应温度(B)、碳酸氢钠/黄芩苷的摩尔比(C)和五水硫酸铜/黄芩苷的摩尔比(D)4个因素，以转化率为指标，设计L9(34)正交试验因素水平，见表1。

表1 正交试验因素水平Table 1 Factors and levels for orthogonal test

1.3.2 黄芩苷铜对大肠杆菌 K88肠毒素释放量的测定 本课题组前期试验(未发表)测得黄芩苷铜对大肠杆菌 K88的最小抑菌浓度(MIC)为750 μg/mL，K88在生长过程中只分泌不耐热 LT 肠毒素，不分泌耐热 STa 肠毒素。本试验设置5个组：空白对照组以及750、375、187.50 μg/mL和93.75 μg/mL浓度黄芩苷铜处理组，分别对大肠杆菌K88菌液进行处理，恒温培养箱中孵育6 h 后取出菌液，移至1.5 mL 离心管中，离心15 min(2 500 r/min、4 ℃)，取上清液于-20 ℃冰箱保存备用。按照ELISA试剂盒说明书操作方法检测细菌培养上清液中猪源大肠杆菌 LT的释放量。

1.3.3 黄芩苷铜处理前后大肠杆菌 K88细胞超微结构变化观察 基于1.3.2试验结果，设置空白对照组和375 μg/mL浓度黄芩苷铜处理组，通过扫描电镜观察猪源大肠杆菌 K88细胞超微结构的变化。

1.3.4 统计分析 采用SPSS 19.0统计软件进行正交试验设计和方差分析。P<0.05表示主效应差异显著，P>0.05表示主效应差异不显著。

2 结果

2.1 正交试验

2.1.1 正交试验安排及结果 由表2可知，r最小值为1.63，即因素反应温度(B)对试验的影响最为不显著，r值由大到小顺序为rC>rA>rD>rB，可知4种因素对黄芩苷铜转化率的影响大小程度依次为C>A>D>B；最佳合成工艺为A3B2C1D2，即6.2 mmoL 黄芩苷加入水中，加热，60 ℃时滴加7.44 mmoL碳酸氢钠水溶液，搅拌加入9.3 mmoL 五水硫酸铜水溶液，反应75 min，加入甲醇搅拌得黄芩苷铜。

表2 正交试验安排及结果Table 2 Design and results of orthogonal test

2.1.2 试验数据验证 按筛选得到的最佳合成工艺进行3次验证试验，得到的转化率分别为87.61%、89.91%和88.76%。

2.2 黄芩苷铜对猪源大肠杆菌 K88的作用

2.2.1 黄芩苷铜对猪源大肠杆菌LT释放量的影响 经不同浓度的黄芩苷铜处理6 h后，大肠杆菌 K88培养上清液中LT释放情况如图1所示，与空白对照组相比，375 μg/mL 和750 μg/mL 浓度黄芩苷铜处理组分别显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)抑制K88中LT的释放，表现为直接的抗毒素作用；而187.50 μg/mL 和93.75 μg/mL浓度黄芩苷铜处理组不能显著抑制LT的释放(P>0.05)。

图1 不同浓度黄芩苷铜对LT释放量的影响Fig.1 Effect of different concentrations of baicalin-copper on release of LT与空白对照组比较，*：P<0.05；** ：P<0.01Compared with the blank control group,*：P<0.05；** ：P<0.01

2.2.2 黄芩苷铜对大肠杆菌 K88超微结构的影响 由图2可知，空白对照组猪源大肠杆菌K88细胞壁完整，胞浆充足，生长状况良好，而375 μg/mL浓度黄芩苷铜处理组大肠杆菌出现了明显的细胞质流失，可发现已死亡的细菌。

图2 黄芩苷铜处理前后大肠杆菌 K88超微结构的变化Fig.2 Ultrastructural changes of Escherichia coli K88 before and after baicalin-copper treatment

3 讨论

3.1 黄芩苷铜合成工艺参数优化 本试验采用正交试验设计进行工艺参数优化，该方法只需安排少量试验，即可分析出影响试验规律的主次因素，统计分析可以迅速简捷分析出合成工艺中的优化条件[7]。在兽用药品研究中有应用正交试验设计对中兽药进行提取优化的报道[8]，而进行中兽药化学正交试验设计及数据处理的案例极少，具有推广和普及价值。

本试验尝试进行正交试验设计，优化黄芩苷铜合成工艺参数。试验选取反应时间(A)、反应温度(B)、碳酸氢钠/黄芩苷的摩尔比(C)和五水硫酸铜/黄芩苷的摩尔比(D)4个因素，以转化率为指标，设计L9(34)正交试验，优选出的最佳合成工艺为：6.2 mmoL 黄芩苷加入水中，加热，60 ℃时滴加7.44 mmoL 碳酸氢钠水溶液，搅拌加入9.3 mmoL 五水硫酸铜水溶液，反应75 min，加入甲醇搅拌得黄芩苷铜。该方法简单，易于控制，最终产物的含量和收率高。

3.2 黄芩苷铜对猪源大肠杆菌 K88的抗菌作用 仔猪腹泻是由产肠毒素性大肠杆菌(ETEC)引起的一种高度接触性、急性和致死性传染病[9]。ETEC 的主要致病因子是定居因子和肠毒素[10]。致病过程主要是 ETEC 通过特异性定居因子吸附到小肠黏膜上皮细胞，使菌体定植于肠道并大量繁殖，引起仔猪剧烈水样腹泻和迅速脱水死亡[11]。为控制大肠杆菌病，养猪场滥用抗生素，导致E.coli对诸多抗生素的耐药性大大增强，抗生素治疗时产生药物残留等诸多不利因素，这些都为仔猪腹泻病治疗带来了困难。因此，养猪业的替抗方法备受人们关注。

从天然药物中寻找具有抗菌和抗毒素双重作用的防治仔猪腹泻药物是近年来学者研究的热点。中药黄芩在临床上具有良好的抗病原微生物和抗炎活性，主要用于治疗肺热咳嗽、湿热泻痢等症。在兽医治疗中，黄芩对细菌性感染后期毒血症、败血症疗效显著。黄芩苷具有多种生物活性，其中抗菌杀菌、抗炎和免疫调节作用尤为突出[12-13]。有关研究还发现，黄酮类化合物与金属离子配位后，展现出比母体更强的生物学活性或全新的药理作用[14]。本试验发现，黄芩苷铜能抑制猪源大肠杆菌 K88不耐热肠毒素的释放，引起细胞质明显流失，导致细菌死亡。黄芩苷属黄酮类化合物，其可能通过抑制活性氧(ROS)的产生和炎性小体3(NLRP-3)的表达起到抗炎的作用[15-16]。某些黄酮类配合物抗菌效果与其氧化分裂 DNA 或损伤细菌细胞膜有关，也可能是由于配合物结构、性质发生改变从而使其与 DNA 和蛋白质结合能力更强[4]。

本试验初步分析了黄芩苷铜的合成工艺和抑菌作用，发现其可抑制猪源大肠杆菌 K88不耐热肠毒素的释放，引起细胞质明显流失，导致细菌死亡。本试验结果提示，黄芩苷铜有望作为防治仔猪大肠杆菌病的一种新型、有效的中兽药制剂，可为黄芩苷铜应用于临床防控仔猪腹泻病提供参考依据，对促进养殖业的发展具有指导意义。