内蒙古地区奶牛子宫内膜炎致病菌分离鉴定及耐药性试验

赵红霞 , 王晓凯 , 宋 晨 , 郭文瑞 , 郝普国 , 郭 宇 , 吕向聪 , 麻海澜 , 周伟光 , 樊宏亮

(1.内蒙古农业大学兽医学院 , 内蒙古 呼和浩特 010010 ; 2.鄂尔多斯生态环境职业学院 , 内蒙古 鄂尔多斯 017000 ; 3.内蒙古动物疫病预防控制中心 , 内蒙古 呼和浩特 010010 ; 4. 内蒙古伊利实业集团股份有限公司 , 内蒙古 呼和浩特 010010)

奶牛子宫内膜炎是奶牛产后常发疾病之一，不仅会引起配种时间推迟、产犊间隔延长和产奶量降低，严重时还会导致奶牛屡配不孕，甚至继发其他疾病或死亡。在欧洲和北美，奶牛子宫内膜炎发生率在9.40%～67.00%，而中国奶牛子宫内膜炎发病率在20%～50%[1]。内蒙古自治区作为我国重要的奶牛养殖优势区和乳制品加工生产区，奶牛存栏、奶产量均居全国前列，由于饲养管理水平低等众多因素，奶牛子宫内膜炎的发生率较高，因该病淘汰母牛比例高于50%，给该地区奶牛养殖业带来严重的经济损失，阻碍其健康发展。

相关研究报道，奶牛子宫内膜炎主要由细菌、真菌、支原体、病毒和寄生虫引起，细菌是引起该病最主要的病原[2]。其中，以金黄色葡萄球菌、链球菌、沙门菌、大肠杆菌、化脓棒状杆菌和地衣芽孢杆菌最为常见[3]。目前，奶牛子宫内膜炎的治疗主要以抗菌药物为主，由于临床治疗中频繁地使用甚至是滥用抗菌药物，导致奶牛源性病原菌耐药性增强，给该病的防治带来了更加严峻的挑战。本试验对引起内蒙古地区奶牛子宫内膜炎的主要病原菌进行分离鉴定，并通过体外药物敏感试验测定这些病原菌对常用抗菌药的敏感性,旨在阐明该地区奶牛子宫内膜炎的感染情况、致病菌的类型及其对常用抗菌药物的耐药情况，以期为科学、合理地防治奶牛子宫内膜炎提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌株 标准菌株ATCC 25923、ATCC 25922和ATCC 49619，均购自中国食品药品检定研究院；标准菌株CICC 21482，购自中国兽医药品监察所；试验菌株从呼和浩特周边奶牛场采集的260份子宫内膜炎病料中分离获得。

1.2 主要试剂药品 普通营养琼脂、伊红美蓝培养基、营养肉汤，均购自北京奥博星生物技术有限责任公司；革兰染色液、Barid-Parker(B-P)琼脂培养基、水解酪蛋白肉汤(MH肉汤)、血琼脂培养基，均购自广东环凯微生物科技有限公司；SS琼脂、金黄色葡萄球菌、链球菌生化鉴定管、肠杆菌科细菌生化编码鉴定管，均购自杭州天和微生物试剂有限公司；链霉素、庆大霉素、青霉素、氨苄西林、阿莫西林、头孢噻呋等44种抗菌药物标准品，均购自中国兽医药品监察所。

1.3 主要仪器 HDL360超净工作台，购自哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；HPS-250生化培养箱，购自哈尔滨市东明医疗仪器厂；T6紫外可见光分光光度计，购自北京普析通用仪器有限责任公司。

1.4 病料采集 从呼和浩特市周边奶牛场选取260例患临床型子宫内膜炎且未进行药物治疗的病牛，用无菌采样拭子采集子宫内分泌物，密封后尽快(4 h内)送回实验室进行细菌分离、鉴定。

1.5 细菌的分离鉴定

1.5.1 细菌的分离培养 将采集的病料在无菌肉汤中进行37 ℃恒温培养24 h后，分别划线接种于SS琼脂平板、含5%脱纤维绵羊血的MH琼脂平板、伊红美蓝琼脂平板、B-P琼脂平板，置于37 ℃培养箱中培养24 h。分别挑取4种平板上生长状态良好的单个典型菌落，进行革兰染色、镜检。根据细菌的菌落形态、生长特性及显微镜下细菌的染色和形态特征，对分离菌进行初步鉴定。

1.5.2 分离菌的生化鉴定 将疑似菌分别接种到相应培养基上进行纯化，采用细菌生化鉴定管对纯化的4种菌进行生化鉴定。4种分离菌的生化鉴定，具体操作参照参考文献[4-7]报道的试验方法进行。

1.6 药敏试验 采用微量稀释法，具体操作参照参考文献[4-7]报道的试验方法进行。依据美国临床和实验室标准协会(CLSI)2015年推荐的药敏试验结果判定标准进行判定。当达到质控要求，且培养液对照孔不长菌，试验菌株对照孔有细菌生长，而药液对照孔也无细菌生长时，表明药敏试验结果可信，此时可记录药敏试验结果。当“U”型孔底有肉眼可见的细菌生长而形成的圆形斑点时，认为该孔药物不抑制细菌的生长。而当“U”型孔内清亮、无菌生长时，认为该浓度药物可抑制细菌的生长，每株菌每种药物各浓度的3个重复细菌生长情况均一致时，方可记录结果并确定最小抑菌浓度(MIC)值。将药敏试验的结果用敏感(Susceptible)、中介(Intermediate)、耐药(Resistant)表示。

2 结果

2.1 细菌的分离培养 从260份奶牛子宫内膜炎病料中分离得到的主要病原菌有大肠杆菌、链球菌、金黄色葡萄球菌和沙门菌。4种分离菌的菌株数及检出率见表1。

表1 260份样本菌株分离概况Table 1 Bacterial isolates from 260 samples

2.2 4种分离菌的生化鉴定 结果见表2～表5,4种分离菌均符合相应菌种的生化特性。

表2 大肠杆菌的生化鉴定Table 2 Biochemical identification of Escherichia coli

表3 链球菌的生化鉴定Table 3 Biochemical identification of Streptococcus

表4 金黄色葡萄球菌的生化鉴定Table 4 Biochemical identification of Staphylococcus aureus

表5 沙门菌的生化鉴定Table 5 Biochemical identification of Salmonella

2.3 4种分离菌的药敏试验

2.3.1 大肠杆菌的药敏试验 126株大肠杆菌对21种抗菌药物的药敏试验结果见表6，分离菌对磺胺类、苄胺嘧啶类药物的耐药率均超过98%;对四环素类的四环素、土霉素的耐药率达70%以上；对青霉素类的氨苄西林、阿莫西林，氨基糖苷类的卡那霉素、链霉素以及四环素类的多西环素、多黏菌素E的耐药率在50%～60%；对头孢噻吩、阿米卡星、呋喃唑酮和氟喹诺酮类药物的耐药率均在20%～35%，较为敏感;对头孢噻呋的耐药率仅为13.7%。

表6 126株大肠杆菌的药敏试验Table 6 Drug sensitivity test of 126 Escherichia coli isolates (%)

2.3.2 链球菌的药敏试验 84株链球菌对19种抗菌药物的药敏试验结果见表7，分离菌对四环素、卡那霉素、β-内酰胺类药物耐药情况严重，耐药率在80%以上，但对美罗培南的耐药率较低(47.4%)；对克林霉素、红霉素、罗红霉素和庆大霉素的耐药率在50%～70%；对万古霉素较为敏感，耐药率为26.7%；对3种氟喹诺酮类药物高度敏感，耐药率在2%～5%。

表7 84株链球菌的的药敏试验Table 7 Drug sensitivity test of 84 Streptococcus isolates (%)

2.3.3 金黄色葡萄球菌的药敏试验 53株金黄色葡萄球菌对16种抗菌药物和3种组合药物的药敏试验结果见表8，分离菌对β-内酰胺类药物的耐药率在60%～85%；对红霉素、四环素类的四环素、米诺环素、多西环素的耐药率介于40%～50%；对克林霉素较敏感，耐药率为37.7%；对氟喹诺酮类药物的耐药率在20%～30%；对庆大霉素和3种组合的抗菌药物的耐药性弱，耐药率在7.5%～13.2%；分离菌对万古霉素完全敏感。

2.3.4 沙门菌的药敏试验 21株沙门菌对19种抗菌药物的药敏试验结果见表9，沙门菌对甲氧苄啶和卡那霉素的耐药率均在90%以上；对庆大霉素、四环素类的土霉素、多西环素和β-内酰胺类药物的耐药率均在75%～90%；但对头孢噻肟较为敏感，耐药率为29.0%；对氨基糖苷类的阿米卡星和妥布霉素比较敏感，耐药率低于10%；以上分离菌株未见对4种氟喹诺酮类药物耐药。

3 讨论

本试验对内蒙古地区260份奶牛子宫内膜炎病料进行了病原菌的分离鉴定，结果发现引起内蒙古地区奶牛子宫内膜炎的主要致病菌为大肠杆菌(48.5%)、链球菌(32.3%)、金黄色葡萄球菌(20.4%)和沙门菌(8.1%)。赵清梅等[8]报道引起宁夏地区奶牛子宫内膜炎的主要致病菌为大肠杆菌(55.56%)、金黄色葡萄球菌(35.9%)，这2种致病菌的分离率均高于本试验中内蒙古地区奶牛子宫内膜炎致病菌的分离率。李蕊等[9]报道保定市奶牛子宫内膜炎的致病菌主要为金黄色葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌，该研究报道的奶牛子宫内膜炎主要致病菌的种类与本试验结果基本一致。胡文举等[10]研究发现，河南平顶山地区奶牛子宫内膜炎主要致病菌种类除大肠杆菌外，还有蜡样芽孢杆菌和奥斯陆莫拉菌等，这可能与奶牛品种、地区不同及饲养管理差异等因素有关。

药敏试验结果显示，4种分离菌对抗菌药物均产生了不同程度的耐药性。大肠杆菌和沙门菌对磺胺类药物具有较高耐药性，耐药率高于97%，这可能与临床中不规范使用此类药物有关。本试验结果中，链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌对青霉素类药物耐药率均在75%以上，谭春萍等[11]报道的广西地区引起奶牛子宫内膜炎的致病菌对该类药物的耐药率为95.65%，其原因可能与此类治疗药物的长期使用有关。本试验结果显示，4种致病菌均对氟喹诺酮类药物高度敏感，这与郭素风等[12]报道的宁夏地区和麻延峰等[13]报道的金华地区奶牛子宫内膜炎致病菌对氟喹诺酮类药物敏感情况一致。因此，临床上推荐使用氟喹诺酮类药物作为治疗奶牛子宫内膜炎疾病的首选药物。

综上所述，本试验对内蒙古地区奶牛子宫内膜炎致病菌的分离、鉴定及药敏试验工作可为临床兽医人员提供参考，从而提高本病的治愈率。在生产中对于该病应采取综合防治措施，包括加强饲养管理，定期对环境进行消毒，减少致病菌的传播；严格遵守人工输精、子宫冲洗等操作规程，及时监测奶牛产后21 d内的子宫复旧情况，及早发现并尽早治疗[14]；利用抗菌药物治疗的同时可以使用微生物制剂、激素类药物、中草药制剂等共同防治奶牛子宫内膜炎，减少该病对奶牛场造成的经济损失[15]。