2017—2020年云南省规模猪场常见疫病监测及分析

张智慧 , 舒相华 ， 李鑫汉 , 罗 高 , 李 鑫 , 龚绍荣 , 罗班乾 ，王余磊 ， 张雅靖 ， 黄 鑫 ， 吕 涛 ， 潘 琼 ， 张雅伦 ， 宋春莲

(1.云南农业大学动物医学院 ， 云南 昆明 650201 ； 2.昆明伟牧得生物科技有限公司 ， 云南 昆明 650201 ；3.云南省昭通市畜牧局 ， 云南 昭通 657000 ； 4.云南省保山市畜牧工作中心 ， 云南 保山 678000 ；5.云南省永德县畜牧兽医局 ， 云南 永德 677600)

近年来，云南省养猪业取得迅速发展，但制约养殖户经济收入的因素很多，由于饲养密度不合理、防疫制度和隔离措施不规范等引起的一些常见的急性、烈性传染病，如猪瘟(Classical swine fever，CSF)、猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)、猪伪狂犬病(Pseudorabies，PR)、猪圆环病毒病(Porcine circovirus disease，PCVD)、猪流行性腹泻病 (Porcine epidemic diarrhea,PED)等，目前已成为困扰养猪业的重大问题。混合感染越来越多，给综合防控带来困难，也给养殖户带来巨大的经济损失[1]。为了解云南省规模猪场常见疾病的发病情况，进行动物疫病防控方案制定、疫苗选择和免疫程序优化、外来传染源防控、疫病治疗、病原变异监控等后续工作以减少疫病的发生发展[2]。本试验对云南省部分规模猪场主要疫病进行流行病学调查分析，采用聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)和酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法分别对抗原和抗体进行检测，以期为云南省规模猪场疾病防控提供有效理论依据及临床数据支撑。

1 材料与方法

1.1 样品采集及处理 2017—2020年收集昆明、楚雄、临沧、保山、宣威、宜良、富源、文山共10个地区规模猪场母猪、种公猪、仔猪和育肥猪的组织和血液样品共 12 946份，对其中4 118份样品进行抗原检测，8 828份样品进行抗体检测(表1)。将送检血液样品分离血清，备用。

表1 2017—2020年7种疾病的抗原和抗体检测量Table 1 Detection amount of antigens and antibodies of 7 diseases during 2017—2020

1.2 主要仪器设备及耗材 -80 ℃冰箱，购自合肥美菱股份有限公司；PCR仪，购自德国耶拿分析仪器股份有限公司；酶标仪，购自赛默飞世尔科技公司；全血基因组DNA提取试剂盒和病毒核酸DNA/RNA抽提试剂盒，均购自宝生物工程(大连)有限公司；ELISA抗体(血清学)检测试剂盒，购自武汉科前生物有限公司。

猪瘟疫苗：细胞源兔化弱毒株、武汉科前(2015)170041004、中牧江西制药厂(2014)140401004、广东永顺(2013)150251084；猪繁殖与呼吸综合征疫苗：武汉科前JXAI-R株17041064、哈兽研2020003、云南生物制药厂250121064、美国辉瑞；猪圆环2型疫苗：WH株、武汉科前(2013)170041087、大肠埃希杆菌源、普莱科生物160021128、柏林格；伪狂犬疫苗：Bartha-K61株，武汉科前(2016)170041056、齐鲁动保(2015)150257018、海林格生物制药(2014)220527018；O 型口蹄疫Rv-2/O/Rv-1株、中农威特280027542。

1.3 PCR检测方法的建立

1.3.1 引物设计 使用Primer 6.0软件设计引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物信息见表2。

表2 引物信息Table 2 Primer details

1.3.2 扩增反应程序 从组织和血液样品中提取核酸，按以下扩增体系进行扩增。

反转录程序按照：42 ℃ 2 min,50 ℃ 15 min(去除gDNA),85 ℃ 8 s,42 ℃预变性45 min(将RNA反转录为cDNA);4 ℃保存。

cDNA扩增程序分别按照：CSFV：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58.3 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s,共35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存；PRRSV：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，44 ℃退火30 s，72 ℃延伸 1 min，共35个循环；72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存；PRV：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共34个循环；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存；PCV2：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸40 s，共34个循环；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存；HPS：94 ℃预变性10 min；94 ℃变性30 s，56 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸2 min，共30个循环；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存；PEDV：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.4 ELISA检测方法 按照猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪伪狂犬gE、猪伪狂犬gB、猪圆环病毒2型、猪O型口蹄疫ELISA试剂盒说明书进行抗体检测和结果判定。

1.5 数据分析 用Excel 2019对检测结果进行分析统计。

2 结果

2.1 2017—2020年6种疫病抗原检测 如图1所示，2017—2020年CSFV抗原阳性率平均为13.18%，其中最高为2019年(16.35%),最低为2020年(10.92%)，呈逐年上升再下降的趋势；PRRSV抗原阳性率平均为19.74%，其中最高为2018年(30.06%)，最低为2020年(6.09%)，呈先上升再迅速下降的趋势；PRV抗原阳性率平均为14.81%，其中最高为2020年(20.34%)，最低为2017年(10.75%)，呈逐渐上升、下降再上升的趋势；PCV2抗原阳性率平均为46.20%，其中最高为2018年(62.50%),最低为2020年(5.34%)，呈逐渐下降趋势；PEDV抗原阳性率平均为22.06%，其中最高为2017年(27.78%)，最低为2019年和2020年(两年均为20.00%)，呈逐渐下降趋势；HPS抗原阳性率平均为45.58%，其中最高的是2020年(62.00%)，最低的是2018年(31.82%)，呈逐渐下降再上升的趋势。

图1 2017—2020年各病原PCR检测结果Fig.1 PCR detection results of individual pathogens from 2017 to 2020

2.2 混合感染检测 混合感染情况严重，其中2017年CSFV+PRRSV二重感染阳性率最高(8.65%)，其次是2020年CSFV+PCV2(6.65%)；CSFV+PRV、PRV+PRRSV、PCV2+PRV二重感染阳性率呈先上升后下降再上升的趋势。PCV2+PRRSV二重感染阳性率呈逐年上升再下降的趋势，但在2019年未被检测到(图2)。

图2 2017—2020年抗原检测二重感染阳性率Fig.2 Antigen positive rates of double infection from 2017 to 2020

由图3可知，CSFV+PCV2+PRRSV三重感染阳性率2019年最高(2.22%)，CSFV+PCV2+PRV三重感染阳性率2020年最高(1.40%)，PCV2+PRV+PRRSV三重感染阳性率2019年最高(2.22%)；CSFV+PCV2+PRV、PCV2+PRV+PRRSV、CSFV+PCV2+PRRSV和CSFV+PRV+PRRSV这4种三重感染在2018年均有检出，其他年份均有不同程度的混合感染。

图3 2017—2020年抗原检测三重感染阳性率Fig.3 Antigen positive rates of triple infection from 2017 to 2020

2.3 2017—2020年5种疫病ELISA检测 2017—2020年CSF抗体阳性率分别为81.67%、84.82%、91.18%、85.21%，呈逐年上升再下降的趋势；PCVD抗体阳性率分别为90.52%、71.79%、100.00%、50.63%，呈逐年下降、上升再下降的趋势。PRRS抗体阳性率分别为50.47%、71.55%、85.29%、60.75%，呈逐年上升再下降的趋势。FMD抗体阳性率分别为36.81%、66.19%、87.80%、97.20%，呈逐年增高趋势；PR-gB抗体阳性率分别为54.02%、40.80%、58.13%、86.18%,呈先下降再上升的趋势(图4)。

图4 2017—2020年各疫病ELISA抗体阳性率Fig.4 ELISA antibody positive rates for individual diseases from 2017 to 2020

2017—2020年PR-gE抗体阳性率分别为16.49%、26.50%、10.93%、1.11%，呈逐年先上升后下降的趋势，其中2018年最高(26.50%)，2020年最低(1.11%)(图5)。

图5 2017—2020年PR-gE ELISA抗体阳性率Fig.5 ELISA antibody positive rates for PR-gE from 2017 to 2020

3 讨论

本次调查显示，CFSV抗原阳性率2019年最高(16.35%)，低于云南杨晓颖等[3]2017年(20%),高于陕西叶超[4]2018年(7.5%)。PRRSV抗原阳性率2018年最高(30.06%),低于湖南段群棚等[5]2018年(43.41%)、江西袁为锋等[6]2017年(70.86%)，高于四川覃思楠等[7]2016—2017年(平均22.15%)。2017—2019年CSFV和PRRSV阳性率出现上升趋势，原因可能与2018年云南省解除强制免疫有关。PCV2阳性率最高为2018年(62.5%)，高于贵州赵新霞等[8]2018年(26.51%)、四川李海全等[9]2015—2017年(49.2%)，低于贵州徐镀涵等[10]2017年(90%)。PCVD属于免疫抑制性疾病，感染一直居高不下，且有上升趋势，是造成混合感染多发的主要原因。PRV阳性率2020年最高(20.34%)，高于云南宋春莲等[11]2015年(13.33%)，低于苏琳琳等[12]2017年(23.1%)，同时PR-gE阳性率2018年最高(26.5%)，表明规模猪场存在PRV野毒感染，虽然近年来使用基因缺失苗对其防控取得一定效果，但PRV感染仍呈上升趋势，可能原因是PRV出现变异毒株。PEDV阳性率2017年最高(27.78%)，低于牟迪等[13]2015—2017年 (52.13%～83.47%)、海南Zhang等[14]2016—2017年(59.5%)。HPS阳性率2020年最高(62.00%)，高于郭龙等[15]2017年(57.93%)，细菌感染率较高。虽然云南省PEDV阳性率偏低，但与其他病原混合感染对仔猪危害极大，加大了防控难度。近几年来，HPS在我国属于多发性疾病，各地均有不同程度感染的报道。

二重感染阳性率最高为CSFV+PRRSV，2017年阳性率为8.65%，低于张裕祺[16]2014年(31.8%)，高于云南杨润焕等[17]2016—2017年(4.46%)。三重感染与黎军等[18]的报道相比，均为逐年上升，PCV2+PRV+PRRSV三重感染阳性率最高(2.22%)，高于黎军等[18]2015—2019年(0.68%)，低于韦显凯等[19]2014年(2.29%)。近几年来，HPS在我国属于多发性疾病，本试验中2018年部分地区出现与HPS相关的二重感染，PCV2+HPS及PRRSV+HPS二重感染阳性率均为14.28%，HPS高发与PCV2、PRRSV的高发病率密不可分，病毒性肺炎的继发感染使该病防治更加困难。

免疫抗体CSF阳性率最高为2019年(91.18%)，高于丁亮等[20]2018年(80.15%)、山东王宏宇等[21]2017年(76.46%)，低于张卫兵[22]2018年(94.10%)。2019年PCVD抗体阳性率为100%,高于云南顾绍锋等[23]2015—2016年(88.21%)。2020年FMD抗体阳性率(97.2%)高于山西任昊[24](96.97%)、谢增胜[25]2015年(84.84%)。2020年PR-gB抗体阳性率(86.18%)低于四川陈第诗等[26]2016年(93.1%)。2019年PRRS抗体阳性率(85.29%)低于吉林刘晓东等[27]2016年(90.42%)，高于蔡丙严等[28]2018年(57.72%)。通过此次调查分析发现，7个疫病的疫苗保护率基本都在80%以上，表明疫苗保护率效果较好；同时也发现，PR-gB、FMD免疫抗体在2017—2019年低于80%，保护率未达到理想效果，但随着猪场管理者对疫苗免疫意识的提升，保护率也在逐渐上升。