骨质疏松动物模型研究现状与进展

江瑞雪 蒋欣泉 文晋

上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔修复科，上海交通大学口腔医学院，国家口腔医学中心，国家口腔疾病临床医学研究中心，上海市口腔医学重点实验室，上海口腔医学先进技术与材料工程技术研究中心，上海 200011

骨质疏松(osteoporosis，OP)是好发于中老年人的一种常见的全身性骨骼代谢性疾病，以低骨量和骨组织微结构破坏为特征，易导致骨质脆性增加和骨折倾向。OP主要分为原发性和继发性两大类，其中原发性OP约占80%，主要包括绝经后和老年性OP[1]，继发性则是继发于各种全身性或内分泌代谢性疾病的OP。近年来，我国骨质疏松症的患病率有所上升，超过1/3的50岁及以上人群受到影响[2]。2018 年，基于11个省(市)44个县(区)2万余人的大规模、多中心流行病学调查显示，OP已经成为我国50岁以上人群的重要健康问题，中老年女性骨质疏松问题尤为严重[3]。在欧盟，OP患者预计将从2010年的2 800万上升到2025年的3 400万[4]。随着人类预期寿命延长和人口结构改变(人口老龄化)，OP将成为全球范围内更加严重的公共健康问题[4-6]。

关于OP的研究(发病机制、药物筛选、防治手段等)都离不开动物模型的构建和应用[7]。理想的OP模型至少需要符合以下几点[8]：一是简便，即建模方法简单，周期短，建模过程具有较强的可控性和可操作性；二是经济，即建模费用适中，可大批量应用；三是相似性好，能较好地模拟 OP发生和发展的过程。经过长期实践探索，OP研究中模式动物种类繁多，造模方法可概括为诱导建模和基因工程建模两类[9]。最常用的模式动物有小鼠和大鼠，而斑马鱼因其特殊结构与生理特征，与啮齿动物的造模周期长、不便长期动态监测实验等特性互补，近年来也成为了OP研究领域的一种常用模式动物[10]。

本综述主要对目前OP动物模型常用动物、建模方法进行梳理与比较，以及基因工程动物在OP研究中的应用进行整理分析，以期为OP研究领域动物模型的构建和实验设计提供更全面的参考。

1 诱导法建立OP模型

诱导建模最常用的手段是去势法，即通过手术切除动物的卵巢/睾丸来模拟女性绝经后OP或老年男性由于性激素分泌大幅减少而诱发的老年性OP。其中，去卵巢大鼠是美国食品和药品管理局和WHO推荐的研究绝经后OP模型。卵巢切除14 d后胫骨近端干骺端有明显的骨丢失，30、60 d后股骨颈、腰椎体部分别出现显著的骨丢失[11]，3月龄大鼠去卵巢后约50 d骨重塑达到稳定状态，即建立可靠的OP模型[12]。

糖皮质激素诱导的OP是最常见的继发性OP类型[13]，服用糖皮质激素导致骨形成受损，骨折风险在几个月内以剂量依赖性方式增加。同理，维甲酸可影响骨代谢，激活破骨细胞促进骨吸收，使骨重建处于骨吸收大于骨形成的负平衡状态[14]。目前糖皮质激素和维甲酸诱导OP的研究中，根据剂量和给药方式的不同，一般2～6周可成功建模。此外，骨失用亦是导致骨质流失和继发性OP的原因之一，故可用悬吊、固定等方式模拟人类运动功能受限或障碍引起的废用性骨质疏松。

对目前的诱导建模进行归纳，可以分为手术诱导(卵巢切除术、甲状旁腺切除、松果体切除等)、药物诱导(如维甲酸、糖皮质激素等)、饮食诱导(如低钙、磷、维生素D饮食等)、失用性诱导(如悬尾、固定等)等，常用动物包括大鼠、小鼠、兔、羊、猪、狗、斑马鱼和非人类灵长类动物。表1总结了OP常用的诱导建模的动物种类及其优缺点比较。比起控制单因素建模，部分研究者认为联合去卵巢与糖皮质激素等手段建模可以达到更优效果[15]。因此，研究人员必须综合考虑研究目的和关键科学问题，以及每种模式动物的优缺点建立最适合的OP动物模型。

表1 骨质疏松常用动物建模方法及优缺点Table.1 Common animal modeling methods for osteoporosis and their advantages and disadvantages

2 基因工程法建立OP模型

基因工程建模是指通过基因编辑技术将外源性基因插入动物基因组或对动物自身基因进行突变、敲除、过表达等使动物具有骨质疏松特性，常用动物有小鼠和斑马鱼[50]。目前基因工程法建立OP模型仍处于探索阶段，部分研究将基因工程技术与去势法相结合，探究目的基因对于OP的影响，从而有助于临床OP新疗法的研究；另一部分研究旨在探究目的基因敲除或过表达后对于骨骼系统的影响，从而致力于OP发病机制的探索。

2.1 基因敲除动物模型

基因敲除动物模型根据目标基因缺失的靶细胞不同，又分为全身性基因敲除和条件性基因敲除两种动物模型。

2.1.1全身性基因敲除动物模型：Priyatha等[51]的研究结果指出p21敲除(p21-/-)小鼠可以防止去势法引起的骨丢失，在非临界大小的颌骨缺损中与野生型对照组相比显示出增强的骨再生。CD73是一种成骨细胞活化剂和骨骼生长的关键调节因子，老龄CD73敲除小鼠骨缺损在骨愈合过程中表现出延迟的骨再生和显著减少的骨基质沉积，且细胞增殖和ALP活性紊乱，骨形成和骨吸收平衡失调，表明CD73的激活可能是改善老年人群骨再生的潜在机制[52]。Akr1A1敲除小鼠(Akr1A1eGFP/eGFP)也表现出骨发育异常和OP，并推测可能是由骨形成受损引起的OP。此外，通过给予抗坏血酸，Akr1A1敲除小鼠表现出可控制的OP，表明了其作为OP研究的新动物模型的可能[53]。

铁紊乱也被证实与OP之间存在某种相关性，大量研究着眼于此开展。Zhou等[54]发现Irp2敲除小鼠显示出骨密度降低、骨小梁质量和结构受损，骨铁缺乏和肝铁超载，与野生型小鼠相比表现出更为严重的OP。Lin 等[55]通过铁转运蛋白1基因

(fpn1)突变体Wehtp85c斑马鱼证明了缺铁可能通过成骨细胞的分化和矿化影响骨形成。姜宇等[56]通过CRISPR/CAS9技术敲除铁调素基因建立了体内铁蓄积的斑马鱼模型，发现成骨基因表达降低，骨发育迟缓，骨量减低。Zhang等[57]、苏幸[58]、Yu等[59]分别通过CRISPR/Cas9基因敲除技术在斑马鱼中产生了ATP6V1H功能缺失突变体、wnt16-/-突变体、nr3c1-/-突变体，证明了相应目的基因的敲除影响斑马鱼骨骼发育，为基因工程法建立斑马鱼OP模型提供了新的思路。

2.1.2条件性基因敲除动物模型：MK生长因子(促血小板生成素)在调节骨骼稳态和造血方面发挥着关键作用，Alvarez等[60]通过删除Mpl基因编码外显子3构建了条件敲除小鼠(Mplf/f；PF4cre)，其中Mpl，主要的MK生长因子受体被特异性敲除，导致了股骨中段的BV/TV显著增加，骨髓基质细胞亦大量增加。毛峰峰[61]利用Cre-loxP系统构建了成骨细胞特异性TGFBR2基因敲除小鼠，发现该转基因小鼠早期生长延迟及骨密度、骨体积、骨形成速率明显降低，血清ALP水平明显下降，最终发生低转换率的OP。Wu等[62]发现小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)中m6A甲基转移酶Mettl3的条件性敲除会诱导OP的病理学特征。同时他们还构建了条件性敲入Mettl3的模型小鼠，与去势的模型鼠相比，Mettl3过表达可预防雌激素不足引起的OP。Lee等[63]首次报道在小鼠中，单核细胞/巨噬细胞特异性敲除破骨细胞前体中受体相互作用蛋白140(RIP140)会导致松质骨减少，破骨细胞活性增加，成骨细胞活性降低，骨形成减少。

2.2 基因过表达动物模型

Nancy Karam等[64]发现过度表达在骨骼和关节发育中十分重要的同源盒转录因子配对样同源结构域1(PITX1)的转基因mCol1α1-Pitx1小鼠会表现出严重的老年性OP表型，其骨量、骨密度和生物力学强度显著降低，提示其作为老年性OP动物模型的可能。核因子κB受体活化因子配体(RANKL)在一系列退行性骨疾病的由破骨细胞诱导的骨吸收中起关键作用。在Vagelis Rinotas等[65]的研究中，他们产生了携带人类RANKL基因组区(huRANKL)的转基因小鼠(TghuRANKL)，实现了不同程度的RANKL过表达，同时表达不同量级RANKL的转基因小鼠表现出有差异的OP。Jochen Schulze等[66]发现在成骨细胞中特异性过度表达Krm2的Col1a1-Krm2转基因小鼠会发展为严重的OP，小梁骨体积和小梁数量减少，生物力学稳定性降低，骨脆性增加，骨形成受损，骨吸收增加。Kiyoshi Hiramatsu等[67]进行的一项旨在检测γ-谷氨酰转移酶(GGT)在体内致病作用的研究发现过度表达GGT的转基因小鼠通过加速破骨细胞的生成和骨吸收导致骨质减少，并导致OP的形成，亦为OP建模提供了新思路。

2.3 其他

Yin等[68]以重组腺病毒为载体，将AD-APN-EGFP注射到去势大鼠股骨远端前内侧表面构建的骨缺损处，随后植入钛种植体，证实了脂联素(APN)的过表达会引起OCN、Runx2和ALP等成骨标志物表达的明显升高，且去势大鼠的骨整合和植入体稳定性显著增加。Liu等[69]、Huang等[70]、Li等[71]分别用Ad-hWnt10b、GPNMB(糖蛋白非黑色素瘤克隆B)和骨膜蛋白(Postn)转染的方法，证明了在去势条件下以上策略能够在一定程度上促进骨再生，从而可能作为治疗OP的潜在手段，为OP骨再生提供了一种新的治疗思路。

边丽璇[72]通过糖皮质激素和模拟微重力效应处理斑马鱼早期胚胎建立OP模型，以Sal B和AF作为激活剂上调 Nrf2 基因的表达，发现Nrf2过表达可缓解骨代谢失衡。Lu等[73]的一项研究使用了shRNA介导的Pax2重组慢病毒(shPax2)转染小鼠致密骨来源的MSC，建立了一个异位骨形成模型。结果提示Pax2在骨相关疾病的病理生理学中具有一定的作用，抑制Pax2的功能可能会损害新骨形成。

综上所述，OP动物模型的建立包括诱导建模和基因工程建模。诱导建模常用去势法和糖皮质激素诱导。而基因工程建模目前多为全身性基因敲除动物模型和基因过表达动物模型，条件性基因敲除动物模型以及基因敲入动物模型研究较少。而基因过表达动物模型多与去势法相结合，在OP已建立的情况下通过基因过表达手段等进行相应研究。随着基因编辑技术的日益完善、基因工程动物模型的培育成熟，OP发病机制及其相关信号通路研究将有望为临床治疗和疾病预防提供更多新策略。