河南温县地黄轮纹病的病原鉴定

程磊,董卓倬,杜用玺，陈夕军,姚 洁,王铁霖, 贺 振*

(1.亳州职业技术学院 药学院，安徽 亳州 236800；2.安徽中医药科学院亳州中医药研究所，安徽 亳州 236800；3.扬州大学 园艺与植物保护学院，江苏 扬州225009；4.中国中医科学院中药资源中心 道地药材国家重点实验室培育基地，北京 100700)

地黄为玄参科植物地黄(RehmanniaglutinosaLibosch.)的新鲜或干燥块根，具有清热生津、凉血、止血、养阴生津功效[1]，有重要的药用和经济价值，是我国大宗药材之一[2]。地黄主要分布于河南、山西、山东、陕西、河北等省份。地黄病害有多种，主要包括斑枯病、根腐病、轮纹病和病毒病等，这些病害导致地黄减产，严重危害生产[3-5]。河南温县是重要的中药材种植基地，近年来，在该区域发现地黄出现大面积叶片焦枯现象，严重影响地黄生长。据研究报道，地黄叶片上存在轮纹病，不同省份病原鉴定结果存在明显差异，童晓茹[6]等从山东地黄病叶上分离出叶点霉属致病菌，解红娥[7]从山西地黄轮纹病叶上分离得到壳二孢真菌。本研究通过生物学、分子生物学鉴定和柯赫氏法则验证，确定河南温县地黄轮纹病的病原物，为明确地黄轮纹病发病规律及综合防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 病害症状观察和病原菌分离

调查地黄轮纹病的田间发生情况，观察其典型症状，采集不同发病期的地黄叶片。用无菌水冲洗其表面，在病健交界处，切取约5 mm × 5 mm的组织块，用0.5%的次氯酸钠溶液清洗1 min，再用无菌水漂洗3次，滤纸吸干后放于PDA平板(含0.5 μL/mL的96%乳酸的马铃薯葡萄糖琼脂培养基)上。PDA平板置于霉菌培养箱内培养3 d，温度设置为22±2℃，菌丝尖端转接于新的PDA平板纯化菌株，获得单孢株DH20-2，于4 ℃冰箱内储存备用。

1.2 菌株形态学鉴定

在20℃下，PDA上生长出良好的菌株，记为DH20-2。观测记录菌株生长情况及菌落的形态和颜色。在显微镜(奥林巴斯BX53)下观测、记录菌株分生孢子梗和分生孢子的形态特征和大小，依据文献[8]进行鉴定。

1.3 菌株分子生物学鉴定

提取菌株DH20-2基因组DNA，采用CTAB法。对菌株的ITS序列进行PCR扩增[3]。PCR反应体系为：上下游引物(10 μmol/L)各2.5 μL，1 PCR buffer 5 μL，Mg2+(25 mmol/L)3 μL，dNTPs(2.5 mmol/L)5 μL，Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.5 μL，DNA 500 ng，无菌水补齐至50 μL。PCR反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃复性30 s，72℃延伸1 min，32个循环；72℃延伸5 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物后，pMD19-T载体克隆送至上海生工测定序列，测序所得ITS序列，进行序列同源性比对。

1.4 致病性测定

柯赫氏法则验证，取健康地黄叶片，用酒精和无菌水清洗叶片表面，晾干。培养5 d，取菌株PDA平板边缘，用无菌打孔器(直径5 mm)打取琼脂块，将有菌丝的一面扣在叶片表面，接种20片叶，同时接种无菌PDA平板样品作为对照。将叶片置于湿润滤纸的塑料盒中，保湿密封，在20℃下培养，观察叶片发病情况。

2 结果与分析

2.1 病害症状

地黄轮纹病在温县祥云镇和夏庄地区发病率达30%。该病发病初期主要在叶部出现褐色病斑，圆形或近圆形，直径2～20 mm，病斑呈现明显轮纹状(图1-A)，后期多个病斑覆盖叶片表面，导致叶片枯死，易形成穿孔(图1-B)。田间湿度较大时，导致地黄大面积叶片枯死，病害严重。

图1 地黄叶片的病害症状

2.2 病原菌形态学特征

20℃条件，在PDA培养基上培养DH20-2菌株，图2-A中菌落刚开始呈白色絮状，菌丝致密，之后逐渐出现浅粉色，略带有紫色，约14 d后在菌落表面形成分生孢子梗和分生孢子。挑取培养14 d的菌丝，在显微镜下观测分生孢子梗和分生孢子。分生孢子梗为瓶梗，小型分生孢子(图2-B)聚于瓶梗顶端，单孢，无色，卵型，大型分生孢子镰刀型，略弯曲。该病原菌与郑瑞瑞等[8]描述的尖孢镰刀菌F.oxysporum的形态特征相似。

图2 尖孢镰刀菌的形态

2.3 分子生物学鉴定

供试菌株DH20-2的ITS序列，通过扩增、克隆及测序，得到一条510 bp的片段。在NCBI中，进行同源性比对，该菌株的ITS序列与尖孢镰刀菌(F.oxysporum，登录号KF998987)的同源性达到99.80%。构建系统发育进化树，结果(图3)显示，菌株DH20-2与F.oxysporum形成一个明显的分支；同属其它真菌也明显形成分支，每个分支之间有很高的支持率。综合病原菌的形态特征、致病性分析、基因序列同源性比对以及系统发育树分析，确定河南温县地黄轮纹病的病原菌为镰刀菌属真菌F.oxysporum。

图3 基于ITS基因的镰刀菌种系进化树

2.4 致病性测定

在健康地黄叶片上，接种菌丝块，接种叶片3 d后发病，发病率为100%。病斑于接种处向外扩延，呈现黑褐色，接种地黄叶片与田间地黄叶片的发病症状相同。PDA琼脂块接种的阴性对照叶片均未发病(图4)。再次组织分离纯化接种发病叶片，得到相同病原菌株，证明所接种的菌株为地黄轮纹病的致病菌。

图4 DH20-2菌株在地黄叶片上的致病性试验

3 结论与讨论

河南省是中药材大省，地黄为四大怀药之一，地黄的叶部病害主要为轮纹病，导致地黄叶片枯死，严重时整株枯死，对生产造成巨大的损失。本研究从表现轮纹病的地黄叶部分离得到菌株，对之进行形态学观察、ITS序列测序以及同源性比对，发现病原菌与尖孢镰刀菌同源性达到99%以上，结合系统发育进化树分析，初步确定在温县地区地黄轮纹病分离获得的病原为尖孢镰刀菌。目前研究表明地黄轮纹病病原多为壳二孢真菌、Phoyllostictadigitalis[9]、AscohytamollerianaWinter[10]等，而由尖孢镰刀菌引起的地黄轮纹病未见报道。镰刀菌引起的多为根部病害[11-13]，引起叶部病害报道也在增多，尖孢镰刀菌引起浙江磐安杭白菊叶枯病[14]。广州地区因空气相对湿度大，由尖孢镰刀菌引起的金心也门铁叶斑病愈演愈烈[15]。

本研究中，离体致病性测定实验结果显示，分离获得的尖孢镰刀菌DH20-2菌株能引起离体地黄叶片产生黑褐色坏死症状，这表明尖孢镰刀菌也可能在地黄上引起轮纹病。朱畇昊等[16](2021)从野生地黄中分离内生真菌尖孢镰刀菌，且发现对地黄生长具有促生作用，而本实验的柯赫氏法则验证，仅做了离体地黄叶片致病性测定，活体地黄的致病性接种实验还有待进一步确定。本研究结果扩大了温县地区地黄轮纹病的病原菌类别，为地黄轮纹病的有效防治提供了新的依据与思路。