重金属铜、锌对火炬树幼苗生长及生理指标的影响

杜 雪，彭玉兰，张新彤，张新锐，李美玄，罗合一，陈国伟，曲同宝

(吉林农业大学园艺学院，长春 130118)

【研究意义】目前，国家强调贯彻绿色发展，促进生态环境持续改善，努力建设人与自然和谐共生的现代化[1]，但随着经济的快速发展，工业化进程的加剧，城乡建设排放的废弃物、生活垃圾，以及农业所用的污水灌溉，农药化肥的不合理施用，使土壤重金属污染等环境问题日益凸显[2]。据调查显示，我国重金属铜点位和锌点位超标率为2.1%和0.9%[3]，而铜(Cu2+)、锌(Zn2+)也是植物生长所必须的微量元素，当植物体内铜含量达到30 mg/kg、锌含量达到400 mg/kg时，会导致大多数植物中毒[4]，还会造成土壤污染。因此，修复和改善土壤污染，成为亟待解决的问题。【前人研究进展】近年来，国内外学者针对土壤重金属污染修复技术领域进行了大规模的探索与研究并取得了一定成果[5]。植物修复技术是利用植物自然生长，通过吸收等作用机制来修复重金属污染的土壤，待植株成熟后再进行处理的一种原位修复技术，因其具有经济、绿色、环保及对土壤扰动小等优点，更适合生态的可持续发展[6]。筛选出超积累植物对于植物修复技术尤为重要，但目前报道的超积累植物主要以草本为主，如铜超富集植物鸭跖草、酸模、印度芥菜等[7-9]，锌超富集植物东南景天、长柔毛委陵菜、天蓝遏蓝菜等[10-12]；目前筛选的过程中发现超富集的乔木和灌木数量较少，但也有耐性强的乔木，如耐锌的紫丁香，耐铜的榆树、桑树、珍珠梅等[13]虽具有耐性但存在植株矮小，生长缓慢，生长周期较长，生物量少以及区域分布性较强等缺陷，严重限制了修复效率[14]。进一步筛选出生物量大、生长速度快、适应性强、经济效益高的重金属超积累植物或耐性强的植物，为重金属污染土壤修复提供更多植物选择。【本研究切入点】火炬树(RhustyphinaL．) 是漆树科( Anacardiaceae )盐肤木属(Rhus) 落叶灌木或亚乔木，因观赏价值高被作为园林观赏树种；从1959年被引种后，在应用中发现火炬树根系发达、分布较浅且萌蘖能力极强，对环境适应能力强，具有非常强大的生命力，可用于重金属修复的选择性植物[15-16]。之前研究发现，生长在铅锌尾矿中的火炬树生物量大，生长较高[17]；盆栽实验中火炬树对镉、铅污染有较强的抗性及富集能力[18-20]，但目前缺乏火炬树对重金属铜、锌的耐性研究。【拟解决的关键问题】研究不同浓度Cu2+、Zn2+溶液对火炬树种子进行单一及复合胁迫处理，探讨火炬树受毒害后的生理响应、抗逆效果以及各耐性机制的变化，以期为修复重金属铜、锌污染的土壤提供植物选择。

1 材料与方法

1.1 试验材料

火炬树种子采自于吉林农业大学校园内，千粒重为 9.837 g(去除红色绒毛状蜡质外种皮后)。

1.2 种子处理

挑选大小均一、颗粒饱满、健康的种子用90 ℃开水进行浸种处理，等开水冷却后再浸泡24 h，用蒸馏水冲洗数次洗去种皮残渣，再用无菌滤纸吸干种子水分，用于发芽试验[21]。Cu2+、Zn2+的供源分别为CuSO4·7H2O和ZnSO4·7H2O，均为分析纯试剂，设置以下重金属浓度。在培养皿中添加Cu2+(0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 mmol/L)、Zn2+(0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mmol/L)，Cu2++Zn2+(0.25 mmol/L+0.50 mmol/L、0.25 mmol/L+2.00 mmol/L、0.25 mmol/L+4.00 mmol/L、1.00 mmol/L+0.50 mmol/L、1.0 mmol/L+2.0 mmol/L、1.0 mmol/L+4.0 mmol/L、2.0 mmol/L+0.5 mmol/L、2.0 mmol/L+2.0 mmol/L、2.0 mmol/L+4.0 mmol/L)各浓度组分别记为T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8、T9作为实验组，以不添加Cu2+、Zn2+作为对照。

把经过催芽的种子播种于铺有无菌滤纸并经过消毒的9 cm培养皿中，每个培养皿放入30粒种子，重复3次。依次添加5 mL各重金属处理液，最后将培养皿置于智能人工气候培养箱中[参数设定：相对湿度为60%，光照条件：温度为(25±1)℃，光强为3500 lx，时间14 h]。黑暗条件：温度为(20±1)℃，时间10 h。培养。种子培养期间，每隔2 d，补充2 mL蒸馏水维持一定湿度[19]。每隔24 h观察并记录发芽情况，12 d后进行各生理指标的测定。

1.3 生长指标的测定

以胚芽或胚根的长度达突破种皮2 mm时，每天在固定时间记录火炬树种子的发芽数，待无继续2 d无种子萌发时，发芽期结束，共12 d。在已发芽的各处理中随机选取10粒种子，滤纸吸干水分后，用游标卡尺测量其胚根长、芽长，称量鲜重，最后计算发芽率、发芽势及发芽指数参考任艳芳等[22]，计算公式如下。

发芽率(GR)= 发芽种子数/供试种子数 ×100%

发芽势(GE)= 第3 天内发芽的种子数/供试种子数×100%

发芽指数(GI)= ∑Gt/Dt

1.4 生理指标的测定

培养周期结束后，测定火炬树种子幼苗生理生化指标。超氧化物歧化酶(SOD)采用氮蓝四唑光还原法测定，过氧化物酶(POD)采用愈创木酚显色法测定，过氧化氢酶(CAT)采用紫外吸收法测定，丙二醛(MDA)采用硫代巴比妥酸法[23]测定。

1.5 数据分析

试验数据用Excel 2010进行数据整理，单因素方差分析和差异显著性检验使用软件SPSS 17.0，Origin V8.0制图。

2 结果与分析

2.1 Cu2+、Zn2+单一及复合胁迫对火炬树种子萌发及幼苗生物量的影响

如表1～3所示，在不同浓度Cu2+、Zn2+单一及复合胁迫处理下，火炬树种子的发芽率、发芽势、发芽指数、幼苗根长、芽长以及鲜重均产生显著的影响(P<0.05)。单一Cu2+胁迫下，当Cu2+浓度为0.25 mmol/L时显著促进了各指标的增长，随Cu2+浓度的升高，各指标呈下降趋势，在2 mmol/L时达到最小值，发芽率降低至对照的15.75%，发芽势是对照的23.00%，发芽指数是对照的56.37%，胚根长及芽长是对照的83.96%、43.34%，鲜重是对照的40.95%，表明Cu2+对火炬树的毒害更强。单一Zn2+胁迫下，当浓度为1 mmol/L时发芽率、发芽指数、幼苗根长、芽长以及鲜重显著高于其他处理组并达到最大值，其幼苗形态和长势也高于对照。在复合胁迫下，各指标随Cu2+、Zn2+含量的上升而降低，且各指标均低于单一Cu2+、Zn2+处理组，最低值出现在T9。Cu2+、Zn2+对火炬树种子发芽及生长过程中表现出协同作用。

表1 Cu2+对火炬树种子萌发的影响Table 1 Effects of Cu2+ on seed germination of Rhus typhina

表2 Zn2+对火炬树种子萌发的影响Table 2 Effects of Zn2+ on seed germination of Rhus typhina

表3 Cu2+和Zn2+对火炬树种子萌发的影响Table 3 Effects of Cu2+ and Zn2+ on seed germination of Rhus typhina

续表3 Continued table 3

2.2 Cu2+、Zn2+单一及复合胁迫对火炬树生理指标的影响

2.2.1 对SOD酶活性的影响 从图1可以看出，与对照相比，单一胁迫下，火炬树幼苗叶片中SOD酶活性随重金属浓度的增加，表现出先升高后下降的的趋势。单一Cu2+胁迫下，火炬树叶片中SOD酶活性，在0.50 mmol/L时活性最高，比对照提高了57.54%，在Cu2+浓度为2.00 mmol/L，高浓度胁迫下，SOD酶活性低于对照。单一Zn2+胁迫下，当浓度SOD酶活性显著降低并且达到最小值，是对照的39.25%，酶活性抑制作用强烈。复合胁迫下，T1处理中火炬树叶片中SOD酶活性显著大于对照及单一Cu2+胁迫，其余处理随Cu2+含量的增加而下降，在T9处理时，SOD酶活性显著降低并且达到最小值，是对照的39.25%，重金属对酶活性抑制作用强烈。

(a)单一Cu2+胁迫处理(mmol/L)；(b)单一Zn2+胁迫处理(mmol/L)；(c)Cu2+、Zn2+复合胁迫处理T1：(0.25+0.50)mmol/L、T2：(0.25+2.00)mmol/L、T3：(0.25+4.00)mmol/L、T4：(1.0+0.5)mmol/L、T5：(1+2)mmol/L、T6：(1+4)mmol/L、T7：(2.0+0.5)mmol/L、T8：(2+2)mmol/L、T9：(2+4)mmol/L。不同小写字母表示同一指标下不同处理间差异显著(P<0.05)，下同(a)Cu2+ dose in solution(mmol/L);(b)Zn2+ dose in solution(mmol/L);(c)Cu2+ and Zn2+ composite stress treatment T1:(0.25+0.50)mmol/L, T2:(0.25+2.00)mmol/L, T3:(0.25+4.00)mmol/L, T4:(1.0+0.5)mmol/L, T5:(1+2)mmol/L, T6:(1+4)mmol/L, T7:(2.0+0.5)mmol/L, T8:(2+2)mmol/L, T9:(2+4)mmol/L. Different lowercase letters to indicate that there are significant differences between different treatments under the same index at 0.05 level.The same as below图1 Cu2+、Zn2+单一及复合胁迫对火炬树SOD酶活性的变化Fig.1 Changes of SOD in Rhus typhina under Cu2+ and Zn2+ single and combined stress

2.2.2 对POD酶活性的影响 从图2可以看出，单一及复合胁迫下，POD酶活性随浓度的增高呈递增的趋势。在单一Cu2+、Zn2+胁迫浓度最高时，POD酶活性急剧上升，分别是对照的4.04、3.81倍，表现出强烈的促进作用。在复合胁迫下，T1～T3处理组，POD活性增长缓慢，至T7～T9处理组时POD酶活性迅速提高，并均高于其他复合及单一Cu2+、Zn2+处理，说明高浓度的Cu2+会促进POD酶活性，且促进作用高于Zn2+。

图2 Cu2+、Zn2+单一及复合胁迫对火炬树POD酶活性的变化Fig.2 Changes of POD in Rhus typhina under Cu2+ and Zn2+ single and combined stress

2.2.3 对CAT酶活性的影响 从图3可以看出， Cu2+、Zn2+单一胁迫下，火炬树CAT含量随浓度的升高而增加，在Cu2+浓度1 mmol/L时，CAT含量高达15.9 U/g，比对照升高了29.26%。单一Zn2+胁迫下，与对照相比，CAT含量在Zn2+浓度1 mmol/L时达到最大值，增加了9.19%。在复合胁迫下，CAT含量均低于对照，低浓度Zn2+水平上，Cu2+浓度的升高，CAT保持较高水平；在相同Cu2+浓度下，Zn浓度的增高使CAT含量持续下降，在T9处理时，达到最低值，仅3.2 U/g，显著降低。

图3 Cu2+、Zn2+单一及复合胁迫对火炬树CAT酶活性的变化Fig.3 Changes of CAT in Rhus typhina under Cu2+ and Zn2+ single and combined stress

2.2.4 对丙二醛含量的影响 从图4可以看出，单一Cu2+、Zn2+及复合胁迫的处理下，火炬树叶片中丙二醛含量均高于对照组，且随浓度的增加大致呈上升趋势，各处理间差异显著(P<0.05)。单一Cu2+、Zn2+胁迫下，叶片中丙二醛含量最高值分别出现在Cu2+2 mmol/L和Zn2+4 mmol/L时，比对照增加了124.54%、119.54%。Cu2+胁迫下丙二醛含量的上升幅度高于Zn2+胁迫。在复合胁迫下，火炬树叶片中丙二醛含量在相同水平Cu2+处理下，随Zn2+浓度的增加而上升，在Cu2+浓度为1 mmol/L处理下，Zn2+浓度的升高，上升幅度较同水平Cu2+0.25和2 mmol/L处理组平缓。

图4 Cu2+、Zn2+单一及复合胁迫对火炬树丙二醛的变化Fig.4 Changes of MDA in Rhus typhina under Cu2+ and Zn2+ single and combined stress

3 讨 论

3.1 Cu2+、Zn2+单一及复合胁迫对火炬树种子萌发及幼苗生物量的影响

种子萌发是植物感知外界环境的最初生命阶段，也是最敏感的阶段，容易受到外界环境变化的干扰[24]。在重金属Cu2+、Zn2+胁迫火炬树种子的条件下，会对火炬树种子萌发、生长及生物量状况均产生不同程度的影响，其中发芽率、发芽势和发芽指数，胚根长、芽长和鲜重均呈低浓度促进高浓度抑制的趋势，这与Cu2+、Zn2+胁迫地肤种子[25]与包菜种子[26]萌发试验研究结果一致。可能是重金属胁迫会抑制种子内贮藏的淀粉酶和蛋白质的分解，同时降低二者的活性，影响种子在萌发过程中所需的物质和能量，最终使种子的萌发受到抑制[27]。复合胁迫下各生长指标均低于对照组，在相同Cu2+浓度下加入Zn2+会在一定程度缓解单一Cu2+胁迫对各生长指标抑制，并且表现为协同作用。胚根长的毒害程度显著大于芽长，随培养时间和浓度的增加，导致火炬树幼苗胚根长度减短，部分组织易坏死，容易感菌等现象。虽抑制火炬树幼苗的生长，但无死亡现象，表明火炬树种子活力强，具有很强的耐受性。这与蓖麻种子[28]与红小豆种子[29]研究结果一致。因为植物在抗重金属毒害的过程中引起酸分泌的减少，激素调节紊乱，光合、呼吸代谢功能产生不良影响[30-31]。

3.2 Cu2+、Zn2+单一及复合胁迫对火炬树生理指标的影响

4 结 论

随重金属Cu2+、Zn2+溶液浓度的升高，对火炬树幼苗生长和生物量的积累均呈现出“低促高抑”的现象。在Cu2+(<0.25 mmol/L)、Zn2+(<1 mmol/L)处理下火炬树的发芽和生物量达到最大值。

低浓度重金属胁迫下，SOD、CAT上升缓解了重金属对火炬树造成的氧化伤害；高浓度胁迫下显著下降。POD和丙二醛含量在Cu2+(2 mmol/L)、Zn2+(4 mmol/L)以及复合胁迫(Cu2+2 mmol/L+ Zn2+4 mmol/L)下达到最大值，使膜脂过氧化严重，导致植物各细胞受到严重的伤害。

在单一胁迫下，火炬树对Zn2+的耐受程度大于Cu2+；复合胁迫下重金属Cu2+、Zn2+表现为协同作用，对火炬树的毒害显著高于单一胁迫，且对火炬树的各指标的影响更为复杂。本试验仅探讨了单一Cu2+、Zn2+及复合胁迫下火炬树在种子萌发期的生长特性，生理代谢等指标的测定，而重金属胁迫对植物生态及生理机制等影响是多个方面的，例如解毒机制、超微细胞结构分析、富集转运规律、分子水平的研究等还有待进一步研究和探讨。