二甲双胍通过差异表达microRNAs 促进人骨髓间充质干细胞成骨分化

蒋华生，梁沛杰，刘智彬，洪冠豪，杨树凯，魏 波，王家丰*（广东医科大学附属医院.干细胞研发与临床转化中心；.骨科中心，广东湛江 5400)

骨质疏松症(OP) 是一种常见的慢性代谢性骨骼疾病，其特征是骨量减少，骨组织微结构破坏及恶化，导致骨脆性增强，骨折风险增加[1]。人口老龄化和生活方式的改变使骨质疏松症成为世界范围内的一个主要公共卫生问题。现有数据显示，中国大陆所有成年人的骨质疏松症患病率约为7%，城市地区约为10%～20%，50 岁及以上男性、女性分别约为22.5%、40.1%[2]。目前，骨质疏松症已成为21 世纪五大疾病之一，其所引发的并发症发生率明显上升，致残率、病死率也随之增加。临床研究发现长期服用二甲双胍(MF)的2 型糖尿病患者骨质疏松症状有明显改善[3]。同时，体外研究发现MF 可通过多条信号通路促进骨髓间充质基质细胞和成骨前细胞系的增殖和成骨分化，具有明确的促成骨作用[4]。然而MF 促进成骨分化的具体机制目前尚未完全明确。目前对于MF 引起与成骨分化相关miRNAs 研究甚少。本研究意在探讨MF 处理人BMSCs 后miRNAs 表达的变化及其促进BMSCs 成骨分化的作用，为利用MF 改造BMSCs 治疗骨质疏松治疗等骨代谢疾病的治疗提供理论依据与技术手段。

1 材料与方法

1.1 实验样本

收集2017-2019 年广东医科大学附属医院骨科20～25 岁患者手术骨髓样本（广东医科大学附属医院伦理委员会批准，患者本人签订知情同意书）。

1.2 主要实验试剂

单核细胞分离液（Sigma）α‐MEM 培养液、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素‐链霉素溶液、磷酸盐缓冲液（Gibco 公司，美国），二甲双胍（Sigma 公司，美国），成骨诱导完全培养液、成脂诱导完全培养液、油红O 染色液（中国广州铂晋生物科技有限公司），茜素红S 染色液（中国索莱宝生物科技有限公司），CCK‐8 试剂盒（DOJINDO 公司，日本）。

1.3 方法

1.3.1 骨髓间充质干细胞分离培养 收集广东医科大学附属医院骨科20～25 岁患者手术骨髓样本，术前排除骨代谢性疾病、自身免疫性及血液系统疾病等。术中取注射器抽吸骨髓，于生物安全柜中把骨髓血移至15 mL 离心管中，加入等体积的PBS 混匀，混匀后沿管壁缓慢加入另一15 mL 离心管内等体积的单细胞分离液。室温400 g 离心20 min，离心后液体分4 层，吸取第2 层内的液体至15 mL 离心管内，加入10 倍体积的PBS，室温下1 000 g 离心3 min，弃上清，加入细胞完全培养液并接种于10 cm 培养皿内，置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱中培养72 h 后更换培养基，随后每3 天更换培养基。细胞长满培养皿90%左右，用0.25%胰酶消化细胞后冻存或接种到新的培养皿继续培养。

1.3.2 骨髓间充质干细胞的表面标志物及多向分化鉴定 细胞传代至P3 代后，选取生长处于对数期的BMSCs，利用流式细胞仪检测胞表面标志物。操作方法按照试剂盒实验说明书（BD Biosciences 公司，美国）。取BMSCs 接种于6 孔板，完全培养基培养至细胞密度达70%～80% 后，更换成骨或成脂诱导培养基诱导培养20 d 后，分别用0.2%、pH8.3 的茜素红S 或60%油红O 染色，分别观察钙盐结节及脂滴密度。

1.3.3 二甲双胍处理浓度筛选 取P3 代BMSCs 细胞接种于96 孔板中（5×103cell），待细胞完全贴壁后，使用含不同浓度MF（0、0.5、1、2 mmol/L）的α‐MEM 完全培养基，分别处理48、72 h 后，CCK‐8 检测细胞活性差异，每组重复5 次。

1.3.4 二甲双胍促进骨髓间充质干细胞成骨分化 取P3 代BMSCs 细胞接种于12 孔板中（1×105cell），待细胞完全贴壁后，更换含不同浓度MF（浓度分别为0、0.5、1、2 mmol/L）的成骨诱导培养基，间隔3 d 换液，21 d 后茜素红S 染色。

1.3.5 高通量测序筛查miRNAs 差异表达 取P3 代BMSCs 细胞接种到10 cm 细胞培养皿中，细胞完全贴壁后第1 组用成骨诱导培养基培养，另2 组在成骨诱导培养基中添加终浓度为1 mmol 的MF。分别诱导7、14 d 后收取两组细胞提取总RNA，委托广东吉赛生物科技有限公司按照miRNA 高通量测序要求建库并进行miRNA 转录组测序，分析各组细胞miRNAs 表达谱。对比不同分组miRNAs 表达量差异，筛选BMSCs 成骨分化过程MF 处理引起的显著差异表达miRNAs。

1.3.6 RT‐qPCR 表达验证 根据上述转录组筛选的差异表达miRNAs 设计相应的PCR 引物，利用实时荧光定量PCR（RT‐qPCR）验证MF 处理引起的显著差异表达miRNAs 及其成骨分化相关靶基因的转录表达水平。

1.4 统计学处理

实验数据资料用GraphPad Prism8.0 软件分析，计量资料以表示，组间比较采用t检验，以P<0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 骨髓间充质干细胞提取与鉴定

2.1.1 细胞形态 骨髓间充质干细胞呈现多角形或棱形的贴壁生长，培养至P3 代，镜下细胞以棱形为主并呈涡旋样生长，形态符合干细胞生长特征，见图1。

图1 显微镜下BMSCs 生长状态（40×）

2.1.2 诱导成骨分化 取用P3 代BMSCs 添加成骨分化诱导培养基，诱导成骨分化21 d 镜下可见多个明显的钙盐沉积形成的结节；利用茜素红S 染色，发现钙盐结节能够被茜素红S 染成亮红色，见图2。

图2 hBMSCs 成骨诱导分化21 d

2.1.3 诱导成脂分化 取用P3 代BMSCs 添加成脂分化诱导培养基，诱导成脂分化28 d 镜下可见大多数细胞中分布多个明显的脂质液滴亮点；利用油红O 染色，镜下观察发现细胞中脂质液滴被油红O 染成规则的红色圆形液滴，见图3。

图3 hBMSCs 成脂诱导分化28 d

2.1.4 流式鉴定 流式细胞仪检测P3 代BMSCs 的表面抗原，其中间充质干细胞阳性表达标记（包括CD90、CD105、CD73）表达率分别为98.6%、99.4%、99.9%；而间充质干细胞阴性表达标记（包括CD34、CD45、CD1b 等混合）表达率为0.03%，符合间充质干细胞的表面标记，见图4。

图4 流式细胞仪检测hBMSCs 细胞表面抗原

2.2 二甲双胍浓度的筛选

在BMSCs 培养基中添加0、0.5、1、2 mmol/L 浓度MF 处理，利用CCK8 试剂盒检测细胞活力。与0 mmol/L 浓度比较，0.5、1、2 mmol/L MF 处理72 h 后其细胞活力均高于0 mmol/L MF 组(P<0.05)，见图5。

图5 二甲双胍处理BMSCs 浓度的筛选

2.3 二甲双胍促进BMSCs 成骨分化

茜素红S 染色后观察不同浓度MF 处理BMSCs 成骨分化钙盐结节的影响，添加低浓度MF 处理可以显著促进钙盐结节的生成，但是随着MF 浓度的升高，这种促进作用逐渐降低，见图6。

图6 二甲双胍促进BMSCs 成骨分化

2.4 二甲双胍处理BMSCs 后miRNAs 差异表达

通过比较MF 体外处理BMSCs 并诱导成骨分化7、14 d 后与空白对照组miRNAs 表达谱的差异，筛选出5 条显著差异表达miRNA，包括：miR‐7110‐3p、miR‐6885‐3p、miR‐542‐3P、miR‐4632‐3p 以及miR‐933。与空白对照组比较，miR‐542‐3p、miR‐4632‐3p与miR‐933 在MF 处理7、14 d 后的表达量水平显著下降(P<0.05)，miR‐6885‐3p 与miR‐542‐3P 只在14 d 的表达量水平显著下降(P<0.05)，见图7。

图7 RT‐qPCR 检测miRNAs 在二甲双胍处理BMSCs 后的表达量变化

2.5 成骨相关miRNAs 靶基因的差异表达

利用RT‐qPCR 技术检测二甲双胍处理BMSCs 后成骨分化相关基因（包括ALP、RUNX2、BMP7、OPN、HMGCR、BMP10）的转录水平差异，发现二甲双胍处理后第3 天ALP转录水平空白对照组比较显著升高(P<0.05)，第7 天反而下降，与空白对照组无显著差异，第14 天后呈现再次上调，与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。BMP7、BMP10、RUNX2 与OPN基因在二甲双胍处理前7 天与空白对照组比较差异均无统计学意义，而在处理14 天均表达上调(P<0.05)。脂质代谢相关的基因HMGCR转录水平在二甲双胍处理后7 天表现为表达下调(P<0.05)。见图8。

图8 RT‐qPCR 检测在二甲双胍处理BMSCs 后骨代谢等相关基因的表达量变化

3 讨论

骨质疏松症在世界范围内仍然是一个重大的医学和社会经济挑战，其骨量和微结构的全身性损害极大地增加了脆性骨折的风险[1,5]。目前临床上用于治疗骨质疏松症的药物昂贵且疗效不确切，长期使用药物治疗易发生并发症[6]。人体骨质代谢涉及骨吸收和骨形成过程之间的平衡，在这个过程中，BMSCs 通过迁移以及分化为软骨细胞或成骨细胞，以适应骨的形成和再生。当骨质疏松症和骨不连等骨病发生时，骨平衡被破坏，骨髓间充质干细胞被招募到骨表面，然后分化为成骨细胞形成新骨，其中BMSCs 的成骨分化潜能是抑制骨质疏松症骨量减少的根本[7]。研究发现在骨质疏松症发展过程中，BMSCs 成骨分化能力显著降低，导致骨形成减少以及骨密度下降[8]。近年来，研究证明靶向调控BMSCs 和成骨细胞的功能可显著促进骨形成作用[9]。目前，我国干细胞临床研究正在蓬勃发展，国家卫生部门已经审批针对多种不同适应症的干细胞疗法。BMSCs 被认为是治疗骨质疏松等骨质减少相关疾病最有潜力的方法之一，研究BMSCs 成骨分化过程分子机制，寻找调控手段增强其成骨分化潜能有助于开发骨形成相关适应证的全新治疗方式，具有重要的临床医学意义。

MF 是一种安全、耐受性良好的药物，它主要通过减少肝脏中的糖异生来降低胰岛素抵抗[10]。临床上通常用于治疗肥胖症、胰岛素抵抗和持续性高胰岛素血症的2 型糖尿病患者。最近的研究表明，MF 可以影响新陈代谢和细胞过程，如炎症、氧化损伤、自噬减弱、细胞衰老和凋亡[11‐12]。体内和体外研究显示MF 还可以影响骨骼的稳态，能显著增加全身骨密度、骨小梁体积、骨细胞密度和成骨细胞数，并对骨丢失起到保护作用，降低骨折的风险，还可以影响骨骼的稳态[13]。体外实验显示MF 可促进BMSCs 和成骨前细胞系的增值与分化[4]，同时MF 在体内、外显著促进成骨作用[13‐14]，一项在模型动物体内研究发现MF 治疗明显改善双侧卵巢切除术后大鼠的骨密度和质量受损程度，并提出这种作用可能通过诱导调节骨髓细胞发育来实现[15]。动物体内实验表明MF 可通过抑制骨吸收和刺激小梁骨中的骨形成来防止GC 诱导的骨丢失[16]。也有临床观察发现使用MF 治疗的2 型糖尿病患者血钙、骨钙素以及骨密度显著高于未使用MF 治疗的患者，提示MF可通过促进骨形成改善2 型糖尿病患者骨代谢，有助于降低骨质疏松的发生[3]。在本研究中，我们通过利用不同浓度的MF 处理人BMSCs，结果发现MF 在低浓度水平下对细胞活性没有显著影响，但MF 可显著促进BMSCs 诱导成骨分化过程钙盐结节的数量增加，证明MF 能够在体外显著促进BMSCs 的成骨分化。

在MF 促进成骨分化机制探索方面也有不少发现，有研究表明MF 至少部分通过抑制GSK3β 促进人骨髓间充质干细胞的成骨分化活动[4]，也有研究发现MF 通过孤核受体SHP 介导的RUNX2 反式激活而诱导成骨细胞分化[17]。而最近一项研究表明MF 通过维持成骨细胞功能和血管密度，抑制坏死股骨头的破骨细胞活性，从而防止大鼠股骨头骨缺血性坏死[18]。目前大多数研究表明MF 的促成骨作用可能是通过AMPK 介导途径发挥作用[13,17,19]。此外，也有研究表明MF 可能通过抑制TLR4/MyD88/NF‐κB 信号通路来减轻高血糖诱导的成骨细胞凋亡和分化抑制[20]。然而，MF 促进成骨的具体机制尚未明确。目前，也有研究使用MF 改善成骨分化的探索，Hashemi 等[21]利用带有壳聚糖涂层的TiO2NT 表面实现在持续的时间内将MF 递送到骨骼部位，并在体外证明其具有增强 MSC 细胞附着、增殖和分化的潜力。然而，鉴于MF 是一种主要调节糖代谢的药物，体内直接使用MF 可能存在紊乱糖代谢风险的可能。因此探索MF 调控成骨分化的主要机制并利用该机制精准靶向性调控成骨分化过程则成为一种更为有效的必然手段。

miRNA 早已被证实参与调节骨髓间充质干细胞自我更新和多向分化过程，相关的报道显示多种miRNA（包括miR‐542‐3p[22]、miR‐335‐5p[23]、miR‐15b[24]、miR‐21‐5p[25]、miR‐130a[26]、miR‐1‐3p[27]、miR‐532‐5p[28]等）参与骨代谢，在转录后通过作用于骨形成相关基因表达而参与BMSCs 成骨分化及骨形成。此外，Li 等[29]发现miR‐216a 通过调节c‐Cbl 介导的PI3K/AKT 通路，挽救地塞米松对成骨细胞的抑制，促进成骨分化。Li 等[30]发现miR‐188 是BMSCs 成骨与成脂转换的关键调节因子，可能是治疗老年性骨丢失的潜在靶点。然而MF 处理hUMSCs 后的miRNAs 表达变化及其介导的对成骨分化的调控机制尚未见报道。

为了进一步探索MF 促成骨作用的分子机制，我们利用二代测序技术检测MF 体外处理BMSCs 后miRNA 表达谱，筛选MF 处理引起BMSCs 细胞显著差异表达miRNA，并探索这些差异表达miRNAs 在成骨分化调控过程的作用。通过比较MF 体外处理BMSCs并诱导成骨分化7、14 天后与空白对照组miRNAs 表达谱的差异，筛选出5 条显著差异表达miRNA，包括：

miR‐7110‐3p、miR‐6885‐3p、miR‐542‐3P、miR‐4632‐3p 以及miR‐933。其中miR‐542‐3p 已经被证实可能通过调控BMP7 从而影响成骨过程；其它显著差异表达miRNAs 参与调控成骨的相关报道较少，值得进一步研究具体的相关调控机制。

本研究在明确MF 处理BMSCs 能够显著提高其成骨分化能力，然后利用高通量测序检测BMSCs 成骨分化过程中miRNAs 的变化，初步证实MF 可通过miRNAs 调控成骨分化相关通路最终影响BMSCs 的成骨分化过程。接下来，应进一步研究MF 引起的差异表达miRNAs 调控BMSCs 成骨分化的详细机制，以期为临床应用改造后的BMSCs 治疗骨质疏松症等多种骨代谢疾病提供理论依据。