冬凌草甲素抗结核病理损伤的作用机制研究

李银虹 刘芳琳 鹿振辉 姜昕

结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）侵袭人体后，主要定居于巨噬细胞，固有免疫应答对于宿主抵抗MTB感染至关重要。NOD 样受体家族蛋白3（NOD-like receptor protein 3，NLRP3）是目前研究最广泛、机制了解相对透彻的炎症小体，其在调节固有免疫和炎症信号转导方面发挥着重要作用。研究发现，内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）可活化NLRP3炎症小体介导炎症反应，影响炎症性疾病的发生发展。硫氧还蛋白互作蛋白（thioredoxin-interacting protein，TXNIP）是ERS与NLRP3炎症小体活化之间的关键联系［1-3］。ERS 可通过TXNIP 活化NLRP3炎症小体介导白细胞介素（IL）-1β分泌［4］。ERS也可通过核因子κB（NF-κB）诱导IL-1β前体（pro-IL-1β）表达，并通过TXNIP促进IL-1β 分泌［5］。基于此，寻找可以干预ERS/TXNIP/NLRP3炎症小体信号通路的药物成为目前研究炎症性疾病治疗的一个新靶点。

近年来，宿主导向疗法（host-directed therapies，HDT）成为结核病防治的新型策略。HDT 可通过调节宿主免疫功能来加强机体抗结核作用，同时减轻过度炎症导致的组织损伤，达到既清除MTB又避免机体损伤的目的。HDT 可以与世界卫生组织推荐的直接督导短程化疗（directly observed treatment short-course，DOTS）联用，降低过度炎症反应引起的肺损伤、缩短疾病病程、降低耐药性的发生［6-7］。

我国中草药资源丰富，从中寻找有效中药成分，通过调控宿主免疫功能、增强宿主细胞的抗菌机制以清除MTB、治疗或减轻结核病症状成为目前结核病防治的研究热点。中药冬凌草制剂冬凌草片为临床非处方药，广泛用于抗炎治疗［8］。冬凌草甲素（Oridonin）是从中提取的贝壳烯二萜类天然有机化合物，占冬凌草有效成分的90%以上，为无色针状结晶，具有抗炎、抗肿瘤、免疫调节等功能［9］。He等［10］研究发现，冬凌草甲素通过共价键直接结合NLRP3，抑制NLRP3炎症小体活化，发挥抗炎功能。这提示冬凌草甲素及其类似物可作为治疗NLRP3相关疾病，尤其是慢性疾病的潜在治疗药物。曾庆钟等［11］发现冬凌草甲素通过调节结肠上皮组织ERS从而缓解小鼠结肠炎症。冬凌草甲素在MTB感染中的作用，还未见相关报道，因此，笔者探讨冬凌草甲素在MTB感染的巨噬细胞中的抗炎机制，以期为冬凌草制剂的临床作用机制提供相关实验实依据。

材料和方法

一、材料及试剂

MTB标准株H37Ra、小鼠巨噬细胞Raw264.7保存于本实验室。冬凌草甲素购自上海同田生物技术股份有限公司；DMEM 高糖培养基购自美国Hyclone公司；胎牛血清购自以色列BI 公司；Middle Brook 7H9、7H10培养基购自美国BD 公司；四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、聚氰基丙烯酸正丁酯（bicinchoninic acid，BCA）蛋白浓度测定试剂盒，以及蛋白质裂解液（RIPA）购自上海碧云天生物技术有限公司；兔抗鼠NLRP3、免疫球蛋白结合蛋白（Bip）、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（CHOP）、真核生物翻译起始因子2α（peIF2α）、磷酸化肌醇需要酶1α（pIRE1α）、肌醇需要酶1α（IRE1α）、pp65、磷酸化应激活化蛋白激酶（pJNK）及pp38单克隆抗体购自美国CST 公司，TXNIP单克隆抗体购自美国SC公司，pIRE1α单克隆抗体购自美国NOVUS公司，小鼠抗肌动蛋白单克隆抗体购自美国Proteintech公司；辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的羊抗兔、羊抗鼠二抗购自美国CST公司。

二、方法

1.Raw264.7细胞的培养：Raw264.7细胞用含10%胎牛血清的DMEM 培养基，放置于37℃、含5%CO2的培养箱中培养。

2.冬凌草甲素对Raw264.7细胞的细胞毒性实验：冬凌草甲素用二甲基亚砜（DMSO）溶解制备成100 mmol/L的药物储液，Raw264.7细胞生长至对数期，收集后铺板于96孔板中，细胞浓度为2×104/孔，加入不同浓度（0.5、1.0、2.0、4.0、8.0μmol/L）的冬凌草甲素，并设空白组、DMSO 对照组，每组设6个复孔。放置于37℃、含5%CO2的培养箱中分别培养24、48、72 h 后，避光加入MTT，10μl/孔，放入培养箱继续培养4 h，酶标仪测定各孔的吸光度值（A490值），根据各孔平均值，绘制细胞生长曲线。细胞存活率（%）=（A490值-A空白组值）/（ADMSO组值-A空白组值）×100%。

3.MTB标准株H37Ra的培养：H37Ra菌株用含有10%白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶（albumin dextrose catalase，ADC）营养添加剂的Middle Brook 7H9液体培养基，37℃培养箱培养生长至对数期。

4.H37Ra 菌株感染巨噬细胞模型的建立：Raw264.7细胞离心收集后，铺板于6孔板中，细胞浓度为1×106/孔，设空白组、模型组、药物处理组，每组3个复孔，37℃培养箱培养过夜。收集生长至对数期的MTB，磷酸盐缓冲液（PBS）洗3遍，按感染复数（MOI，即细菌∶细胞=10∶1）加入模型组、药物处理组，共孵育4 h后，PBS洗3遍，以便弃掉未进入胞内的MTB；而后细胞分别采用不同浓度的冬凌草甲素干预不同的时间，模型组用PBS处理。

5.蛋白免疫印迹法检测Raw264.7细胞相关蛋白的表达水平：以冬凌草甲素（4.0μmol/L）分别处理模型组细胞6、12、24 h。预冷PBS洗3遍后，加入预冷的RIPA 细胞裂解液，冰上裂解30 min。4℃、离心半径10 cm，12 000 r/min离心15 min，收集蛋白上清。BCA法检测蛋白浓度，然后将蛋白与上样缓冲液（loading buffer）混合后煮沸。在SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）上分离蛋白并转印至硝酸纤维素膜上，5%脱脂牛奶封闭2.5 h后，将硝酸纤维素膜转移至预先按1∶1000进行稀释好的兔抗NLRP3、Bip、CHOP、peIF2α、pIRE1α/IRE1α、pp65、pJNK及pp38单克隆抗体，以及鼠抗TXNIP单克隆抗体、小鼠抗肌动蛋白单克隆抗体中，4℃摇床孵育过夜。次日Tris-吐温缓冲液（Tris-buffered saline Tween，TBST）洗3次，每次10 min，然后将膜放入1∶5000稀释的HRP标记的羊抗兔或羊抗鼠二抗中，室温孵育1 h，TBST 洗3次。用增强化学发光（enhanced chemiluminescence，ECL）显影剂在Protein Sample仪器上进行显影，用Image J软件进行图像的蛋白灰度值测定。

三、制图与统计学处理

采用SPSS 26.0软件进行数据分析，正态分布的计量资料以“”描述，组间差异的比较采用单因素方差分析或重复测量数据的方差分析，两两比较采用Turkey’s检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

一、冬凌草甲素对Raw264.7细胞活力的影响

在不同时间点（24、48、72 h）用MTT法检测不同浓度（0.5、1.0、2.0、4.0μmol/L）冬凌草甲素处理后细胞的存活情况。结果显示，冬凌草甲素作用24 h、48 h和72 h细胞的存活率均能保持在90%左右，4.0μmol/L 的冬凌草甲素处理细胞72 h后，Raw264.7细胞的生存率仍能达到（101.60±0.61）%，见表1。为此，后续实验选择4.0μmol/L不存在细胞毒性，为最大药物安全使用浓度。

表1 不同浓度冬凌草甲素作用下Raw264.7细胞的生存情况

二、冬凌草甲素抑制MTB 感染的Raw264.7细胞NLRP3炎症小体活化

利用蛋白免疫印迹法检测NLRP3炎症小体活化情况，以小鼠肌动蛋白为内参。与模型组相比，冬凌草甲素（4.0μmol/L）作用（6、12、24 h）可明显抑制MTB感染的Raw264.7细胞NLRP3和TXNIP蛋白的表达，见表2。

表2 冬凌草甲素作用MTB感染的Raw264.7细胞不同时间对NLRP3炎症小体活化的影响

三、冬凌草甲素抑制MTB 感染的Raw264.7细胞内质网应激

利用蛋白免疫印迹法检测内质网应激相关蛋白（Bip、CHOP、peIF2α、IRE1α及pIRE1α）的表达情况，以小鼠肌动蛋白为内参。与模型组相比，冬凌草甲素（4.0μmol/L）作用（6、12、24 h）可明显抑制MTB感染的Raw264.7细胞内质网应激相关蛋白的表达，见表3。

表3 冬凌草甲素作用MTB感染的Raw264.7细胞不同时间对内质网应激的影响

四、冬凌草甲素抑制MTB 感染的Raw264.7细胞内质网应激IRE1α通路下游蛋白的表达

利用蛋白免疫印迹法检测内质网应激情况。以小鼠肌动蛋白为内参，与模型组相比，冬凌草甲素（4.0μmol/L）作用（6、12、24 h）可明显抑制MTB感染的Raw264.7 细胞IRE1α 通路下游相关蛋白（pp65、pJNK、pp38）的表达，见表4。

表4 冬凌草甲素作用MTB感染的Raw264.7细胞不同时间对内质网应激IRE1α通路下游相关蛋白的影响

讨 论

研究发现，冬凌草甲素对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、白色链球菌、枯草芽孢杆菌及铜绿假单胞菌有明显的抗菌作用［12］。冬凌草甲素可通过减少一氧化氮、肿瘤坏死因子α、白细胞介素-1β（IL-1β）、IL-6释放缓解炎症反应，同时抑制DNA 逆转录酶NF-κB结合，从而减轻脂多糖对大鼠小神经胶质细胞的刺激作用［13］。然而结核病模型中，还未见有关冬凌草甲素的相关报道。

本次实验首先通过MTT法检测冬凌草甲素对Raw274.7细胞的细胞毒性，发现冬凌草甲素在4.0μmol/L浓度以下作用24、48、72 h时细胞的存活率均在90%以上，可见冬凌草甲素在4.0μmol/L浓度下对细胞的毒性较小，因此，本次实验选用4.0μmol/L作为冬凌草甲素的最大安全使用浓度。

MTB感染巨噬细胞可以活化NLRP3炎症小体，介导成熟IL-1β的释放［14-16］。多种信号可诱导NLRP3炎症小体活化，其中，TXNIP与NLRP3的结合在NLRP3炎症小体组装及活化中发挥重要作用［17］。当细胞受到危险信号如尿酸晶体等刺激后，原本与硫氧还蛋白结合的TXNIP与之分离，并与NLRP3直接结合，活化NLRP3炎症小体［18］。相关实验研究发现，干扰TXNIP蛋白表达可在一定程度上阻断NLRP3炎症小体活化，从而影响下游成熟IL-1β的释放［19］。本次研究通过冬凌草甲素干预MTB感染的Raw264.7巨噬细胞，蛋白免疫印迹法检测提示MTB感染后，NLRP3及TXNIP蛋白表达均明显升高，冬凌草甲素作用6、12及24 h后，可明显抑制NLRP3及TXNIP蛋白的表达，TXNIP与NLRP3结合减少，从而抑制NLRP3炎症小体活化。那么炎症小体活化是通过何种机制调控的？笔者又做了进一步研究。

内质网应激激活未折叠蛋白反应后可通过IRE1α和PERK 促进TXNIP 转录，抑制TXNIP mRNA降解，活化NLRP3炎症小体［20］。本次研究通过蛋白免疫印迹法检测发现冬凌草甲素可明显抑制内质网标志蛋白Bip和CHOP［21］的表达水平，同时，明显抑制与Bip 解离的内质网跨膜蛋白pIRE1α、IRE1α及peIF2α的表达，提示冬凌草甲素可明显抑制MTB感染诱导的内质网应激。发生内质网应激后，解离的IRE1α可形成IRE1/TRAF2/ASK1复合物，诱导丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路中的JNK 和p38MAPK 下游活化。MAPK/NF-κB信号传导通路是炎症反应的经典通路，抑制该信号的传导可缓解炎症反应［22］。蛋白免疫印迹法检测结果提示，冬凌草甲素明显抑制MTB感染的Raw264.7细胞中IRE1α通路下游蛋白pJNK、pp38、pp65表达水平。基于以上研究结果，冬凌草甲素在MTB感染巨噬细胞中可能通过调控内质网应激，干预TXNIP/NLRP3 信号通路，从而抑制NLRP3炎症小体活化，发挥抗炎症损伤的作用。

综上所述，基于本研究的结果，笔者推测，冬凌草甲素有可能成为新的HDT 候选药，作为辅助用药与临床一线抗结核药物联合用于结核病的防治。另外，本实验尚存在一些不足之处，例如：细胞模型相对单一、未开展动物体内实验验证等，需在后续工作中进一步完善。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突

作者贡献李银虹：直接参与（实施研究、采集数据、分析/解释数据）、文章撰写（起草文章）、工作支持（统计分析）；刘芳琳：直接参与（实施研究、采集数据）；鹿振辉：直接参与（分析/解释数据）、文章撰写（对文章的知识性内容作批评性审阅）、工作支持（支持性贡献）；姜昕：直接参与（酝酿和设计实验、分析/解释数据）、文章撰写（对文章的知识性内容作批评性审阅）、工作支持（获取研究经费、指导、支持性贡献）