荧光分析实验的教学拓展与探索

贾 莉, 马锴果, 赵 浩, 耿金灵, 朱志伟

(北京大学 化学与分子工程学院，化学国家级实验教学示范中心，北京 100871)

0 引 言

荧光分析技术在基础研究和应用领域具有极大的应用，其教学实验涉及内容广泛。众多高校对荧光分析法实验进行了改进和实验内容更新，结合新技术、新材料，以体现近期的科研进展和研究热点，开拓学生视野，培养和提高学生的综合能力[1-2]。但此类实验面向低年级学生开设，由于学生理论知识欠缺，高度集成化的荧光光度计其重要部件被封闭在黑盒子里，学生在理解荧光光谱法基本概念、光度计结构及工作原理方面存在很多困惑，实验过程基本停留在溶液配制、电脑程序操作和数据记录水平上，实验积极性不高，教学效果不理想。这促使中心不得不重新考虑实验项目的设计。经典实验在培养学生掌握基础知识、基本操作技能、实验方法以及学生的科学思维和科学态度方面具有举足轻重的地位，而且也符合学生的认知规律[3-4]。因此，在传承经典实验项目的基础上，对传统的荧光分析法实验教学模式进行创新，使其更好地面向低年级学生开设具有十分重要的意义[5-6]。

近年来，学生自己动手组装实验仪器并进行仪器应用拓展的教学模式，在提高学生实验兴趣、培养创新能力方面发挥了极其重要的作用[7-10]。目前，这种教学模式在国内的荧光分析法实验教学中还未见相关报道。为此，实验通过利用发光二极管(LED)及乐高积木搭建简易荧光光度计，并应用于硫酸奎宁的定量测定。通过有效的实验教学组织形式，将此实验模块引入到常规实验教学，与经典的荧光分析法实验项目“饮料中硫酸奎宁的定量测定”内容相结合，利用其趣味性来拓展常规实验的教学内容。这种教学模式增加了学生的实验兴趣，促进了学生理论与实践的融会贯通。

1 仪器与试剂

仪器。乐高积木、万用表(UT61B)、面包板(SYB-130)、发光二极管(LED，355 nm)、Si-PIN光电二极管(400～1 100 nm，LSSPD-1.2，LSSPD-2.5，LSSPD-3.2，LSSPD-4.2)、电源模块(2.8～5.5 V转 ±12 V)、运算放大器(OP07CP)、面包板连接线、容量瓶(25 mL)、分度吸量管。

试剂。奎宁储备液(100.0 μg/mL)，避光保存。使用时，以0.05 mol/L H2SO4溶液稀释成10.0 μg/mL的工作液。

2 自制荧光光度计的设计和搭建

2.1 仪器设计思路

利用LED及乐高积木搭建的光度计，结构简单，易于实现，非常适合引入常规实验教学[11-15]。现已报道的自制LED荧光光度计采用LED为检测器，对光路的准值性要求很高；以内阻较大的伏特表为信号采集工具，实验成本高；简易的电路连接方式，测得的光电压值较低，学生不易获得测试数据[13]。这些缺点限制其在实际实验教学中应用。因此，根据实际教学需求，对搭建荧光光度计所需部件及电路连接方式进行了改进和优化，使学生能够及时准确地获得测量数据，仪器的精密度和重复性满足仪器分析实验教学需求的原则，将其引入荧光分析法实验教学中。

硫酸奎宁的最大激发波长为350 nm，选择355 nm的LED灯珠作为单色光源，取代商用荧光光度计中的光栅。检测器的选择是光度计性能优劣关键。基于硅光电二极管在测量光信号时具有响应快、线性好、灵敏度高、噪音小、性能稳定的优点[16]，故搭建仪器时以硅光电二极管作为检测器。根据硫酸奎宁的最大发射为450 nm，可选择400～1 100 nm的Si-PIN光电二极管来实现光电检测功能。万用表作为信号采集工具，其在精密度、可靠性方面具有良好性能，且降低了实验成本。在电路连接方面，采用放大电路可有效克服因光电压值较低而不易获得测试数据缺点[15]。

2.2 仪器搭建

仪器搭建时，将LED灯珠和Si-PIN光电二极管分别塞入已打好孔的乐高，并在背面用医用胶带固定，使两者高度一致且处于垂直位置，再将四面透光的石英比色皿的底部用医用胶带固定在下层乐高上。自制荧光光度计实物连接图(见图1)，详细电路连接方式见文献[15]，其中Si-PIN光电二极管可以选择不同的光敏面直径。测定时，检测器所测得的荧光强度与光电压成正比。为避免外界光对测试结果的影响，应将比色皿四周用乐高进行避光。

图1 自制荧光光度计实物图

3 自制荧光光度计用于硫酸奎宁定量测定的性能探究

3.1 实验内容

(1) 线性范围的确定。向一系列25 mL容量瓶中加入不同体积的奎宁储备液或工作液，以0.05 mol/L H2SO4溶液定容，配制一系列浓度为0.10～100.0 μg/mL的奎宁标准溶液。利用自制荧光光度计分别测试系列奎宁标准溶液的光电压值。以测量得到的光电压V(mV)为荧光强度对奎宁的浓度c(μg/mL)进行线性回归，确定硫酸奎宁在什么浓度范围内与荧光强度呈良好的线性关系。

(2) 标准曲线的绘制。向25 mL容量瓶中分别准确加入0.25，0.50，1.00，1.50，2.00，2.50 mL的10.0 μg/mL奎宁工作液，以0.05 mol/L H2SO4溶液定容，分别利用自制荧光光度计依次测量溶液荧光产生的光电压，拟合线性回归方程，计算相关系数。

(3) 检测限的测定与计算。以0.05 mol/L H2SO4溶液为空白样品分别测定10次，所产生的光电压值按照式①计算自制荧光光度计的检测限[17]。

Ck=3s/k

(1)

式中：Ck为方法检测限；s为空白标准偏差；k为校准曲线斜率。

(4) 重复性和准确度测定。向25 mL容量瓶中用吸量管准确移取0.75 mL的10.0 μg/mL奎宁工作液，以0.05 mol/L H2SO4溶液定容，摇匀，作为待测溶液。利用自制荧光光度计对未知液连续测定6次，计算测定值的相对标准偏差和相对误差。

3.2 数据与分析

(1) 线性范围的确定。不同浓度硫酸奎宁标准溶液的测定结果如图2所示，从测试结果可以看出荧光强度随硫酸奎宁浓度的增大而增加，当硫酸奎宁标准溶液浓度在0～10.0 μg/mL范围内时与荧光强度呈线性关系。随硫酸奎宁溶液浓度的增大，由于自淬灭使荧光强度与浓度偏离线性关系。

图2 不同型号检测器测定硫酸奎宁标准溶液的光电压-浓度线性关系

(2) 线性回归分析及检测限。利用自制荧光光度计分别测定不同浓度的硫酸奎宁标准溶液的荧光光电压，并绘制光电压标准曲线。以奎宁浓度c为横坐标，测定的光电压V为纵坐标作图，得到的标准曲线分别如图3所示。从测定结果可以看出，在测试的浓度范围内，所测得的光电压与奎宁浓度都有着良好的线性关系，表明自制荧光光度计可用来定量测定硫酸奎宁浓度。

(a) LSSPD-1.2型检测器>

按照式(1)的方法计算可得到4种荧光光度计的检测限，见表1。结果显示，相较于光敏面直径为1.2 mm的LSSPD-1.2 型Si-PIN光电二极管，其他3种光敏面积更大的检测器所搭建的荧光光度计的检测限更低且数值相当。

表1 标准偏差(SD)和检测限(LOD)

(3) 重复性和准确度。未知液中硫酸奎宁的实际浓度为0.30 μg/mL，利用不同型号检测器测定未知液的6次测定结果见表2。根据测定未知液浓度的标准偏差可知，测试结果的重复性可以满足教学需求，并且自制荧光光度计测试结果的相对误差均在5%以内，说明测定结果是准确、可靠，满足仪器分析实验的基本要求。

表2 方法重复性和准确度测定结果(单位mg/L)

3.3 性能分析

通过对LED乐高型简易荧光光度计进行改进和完善，将其运用于硫酸奎宁的定量测定，评价使用不同Si-PIN检测器的测定效果，考察了方法的线性范围和仪器的检测限、重复性及准确度。实验结果表明：荧光光度计的搭建过程简单，学生更易及时准确地获得测试结果。且4种不同型号检测器所搭建的仪器性能均能满足仪器分析实验教学需求，可较好地实现硫酸奎宁的定量测定，适合引入到实际教学。

4 教学模式

将荧光光度计搭建及定量测定硫酸奎宁性能探究的实验模块与常规实验项目“饮料中硫酸奎宁含量的测定”实验内容相结合。实验为8学时，学生2人1组，合作完成。实验过程中，注重教师的引导作用，开展不同层次的实验教学。

4.1 注重教师引导，逐步培养学生的探究实践能力

在实际教学过程中，学生在完成常规实验内容的基础上，从仪器的搭建到应用，全过程参与此实验模块。通过常规实验内容的训练，学生掌握了如何利用荧光光度计进行定量测定，仪器的哪些性能会影响测试结果，仪器的使用需要注意哪些问题等。学生掌握了相关的基本实验技能之后，再利用基本的电器元件搭建简易荧光光度计，加深学生对仪器结构及工作原理的认识。以探究型实验教学模式开展自制仪器进行硫酸奎宁定量测定的性能评价的实验内容，指导教师通过和学生一起对得到的实验数据进行分析，讨论这些数据能够说明哪些问题，可以得到什么样的结论，要得到这样的结论还需要什么样的实验来支持和验证等。在这个过程中，逐步培养学生分析判断、逻辑推理、根据实验结果得出实验结论的能力。

4.2 以学生为主，为学生提供充分发挥创造力和想象力的空间

基于自制荧光光度计具有很强的灵活性和直观性，在课时允许的条件下，对那些学有余力，且热情参与探究性实验的同学，可通过以下四个方面来丰富和拓展该自制仪器的应用[13]。

(1) 自制荧光光度计有很强的开放性，通过改变LED光源和检测器数量，如图4所示，测定相应的荧光强度，探索荧光强度对仪器灵敏度的影响。

(2) 温度对荧光强度的影响较为灵敏，通过分别测定室温及冰水浴冷却后的奎宁标准溶液的荧光强度，探索温度对荧光强度的影响。

(3) 荧光淬灭的形式有很多，利用自制荧光光度计可以很直观地观察到不同形式的荧光淬灭现象，如：观察低、中、高浓度奎宁溶液荧光的自淬灭现象，向奎宁溶液中加入不同浓度的NaCl溶液可以观察到由于发生电荷转移反应而产生的荧光淬灭现象等。

(4) 在光源照射下，向盛有硫酸奎宁的比色皿中加入液氮，可观察到明显的磷光现象。

(a)

5 教学效果

自制荧光光度计是教师针对教学的重点和需求，对已报道的仪器进行改进和完善的成果。学生设计的自制荧光光度计实验具有可设计性、内容灵活性和多样性，非常适合应用于荧光分析法实验教学。经过1年的教学实践，学生普遍反映通过搭建仪器，有助于更深刻地理解荧光光度计的结构及工作原理；通过仪器性能探究，有助于将理论与实践融会贯通，激发学习兴趣，培养开发探索能力；同时，实验的开展形式给予了学生极大的自由度和空间，有助于自主且创造性地完成实验并加以拓展。将自制仪器及应用拓展与常规实验相结合的教学模式，是对知识的学习、运用和巩固，也是对传统经典实验教学模式的突破和创新，使之更加适应新的实验教学发展趋势，更加丰富其内涵。同时教师在设计和制作过程中也提高了自身专业水平，进而促进了教学质量的提升。