瘘管法在氨基酸消化率评定中的研究与应用

■余可佳 李玉莲 易学武 范志勇*

（1.湖南农业大学，湖南 长沙 410128；2.湘潭市家畜育种站，湖南 湘潭 411100；3.湖南美龙饲料科技有限公司，湖南 长沙 410128）

饲料氨基酸生物利用率的准确测定是评定其营养价值的重要手段，对动物营养学的研究及其之后的饲料配方设计参数选择影响巨大。根据食糜收集方法的不同，猪饲料氨基酸消化率的测定主要有粪便分析法和回肠末端食糜取样两种代表性操作方法，考虑到猪后肠微生物发酵对饲料有效氨基酸含量的干扰和破坏，氨基酸消化率应在回肠末端取样测定的观点得到了广泛认可。为准确获取饲料蛋白质氨基酸的回肠末端含量，结合荷术猪的生理状况、操作流程及其后续护理等影响因素，与屠宰法和回直肠吻合术（ileorectal anastomosis，IRA）相比，Cunningham首创，经Dierick改进完善的简单T型瘘管法，以其操作简单、护理容易、取样影响小以及食糜阻塞和渗漏现象较少发生等优势，得到了充足发展和广泛应用，已成为现代测定猪饲料氨基酸利用率的首选方法。经前人不断地实践与探索，总结出了T型瘘管和桥型瘘管两种体系。

1 瘘管法概述

1.1 工作原理

瘘管法是利用手术措施给动物安装不同的瘘管，收集各种液体和食糜进行观测和样品分析的方法。最初是在巴浦洛夫开展的消化液分泌条件反射试验中，为观察狗的消化液生理分泌节律，切断食管安装瘘管采取的一种手术操作和样品采集方法[1]。随着科学技术的发展，逐渐发展到多个领域，其中，肠道瘘管（如回肠瘘管）技术已成为猪饲料蛋白质氨基酸营养价值准确评定的有效方法。

T型瘘管法是通过外科手术在肠道内处安装1个T 型瘘管；桥型瘘管则是在肠道2 个不同部位分别安装1个T型瘘管，然后用1个桥型玻璃管将二者相连，因其形状故此得名[2]。二者相同之处都是在肠道某一处安装瘘管，通过瘘管收集样品。其差别在于，T 型瘘管法为点取样法，样品氨基酸测定的准确性和操作流程可以较好地控制，但取样繁琐、瘘管易脱落、必须结合指示剂法以及兼顾多个影响因素[3]；而桥型瘘管法属于定量取样，样本更具有代表性，可不使用指示剂，但瘘管更容易脱落、术后护理难度更大、瘘管之间连接处由于材质和安装问题也更易于发生堵塞[4]。因此，具体应用过程中，要根据现实情况，充分考虑饲粮、动物和样品因素，选择合适的瘘管以期达到最佳效果。常用消化道瘘管安装方法如图1所示。

图1 瘘管安装示意图

1.2 T型瘘管法

Cunningham等[5]自1963年首创了简单T型瘘管法（simple T-cannulas，STC），在回盲瓣前5～10 cm 的回肠末端处植入瘘管，手术的过程及护理比较简单，取样时对消化道功能影响较小，但不能收集全部的回肠食糜且须使用指示剂。经过不断地进行理论深化与技术改进，Van Leeuwen等[6]在STC的基础上发明了瓣后T型瘘管法（post valve T-cannulas，PVTC），PVTC法切除了部分盲肠，增大了瘘管口径，将瘘管安装在回盲瓣后剩余的盲肠内即可收集回肠食糜，但仍需使用指示剂。随后Morz 等[7]提出了可操纵回盲瓣T 型瘘管法（steered ileo-caecal valve，SICV），SICV 是一种更新的用于定量化收集回肠食糜的取样方法，用两个不锈钢环使回盲瓣可移动，在内环系上一根尼龙绳经肠腔到瘘管口牵引出体外。平时食糜流动方向正常，在采样时，通过收紧两个环使得回肠食糜能够完全通过T型瘘管，从而达到全收样的目的，这种方法无需使用指示剂，且较少出现食糜阻塞现象，不过手术安装复杂，对手术人员的技术要求很高，使用寿命不长，如不将回盲瓣完全拉入瘘管内，会导致消化率评估值变高。前两者属于点取样法，需要使用指示剂，后者属于定量取样法，不需要使用指示剂，三者手术难度依次增加，测定值的准确性也依次提高。

1.3 桥型瘘管法

根据近端瘘管的安装位置可分为瓣前桥型瘘管法和瓣后桥型瘘管法，根据远端瘘管位置又可分为回回桥型瘘管法、回盲桥型瘘管法、回结桥型瘘管法和回直桥型瘘管法，其中回盲桥型瘘管法是应用最多的。由于瓣前桥型瘘管法切除了部分肠道，干扰了肌—电兴奋的正常传递，使得回盲瓣正常功能丧失且瘘管易脱落[2]。Darcy等[8]发明的瓣后桥型瘘管法在操作过程中需要切除大部分盲肠，将近端瘘管安装于切除后剩余的盲肠内，回盲瓣保持正常功能，在回肠食糜正常到达结肠部位时正常取样，利用此种方法可以测定粗颗粒的高纤维日粮的消化率，且不会发生食糜阻塞现象。印遇龙[9]对桥型瘘管法进行了更加深入的试验研究，通过改进手术方案和术后护理方法，极大地提高了手术的成功率，为后续的科学研究提供了有价值的参考。

2 瘘管法在猪饲料氨基酸消化率测定中的应用

2.1 瘘管法猪饲料氨基酸消化率的评价

简单T 型瘘管法因其操作简单、重演性强等优势，广泛应用于猪饲料回肠氨基酸消化率的测定。吴士博等[10]给三元杂交生长猪安装简单T 型瘘管，测定4个品种饲料稻糙米的表观回肠氨基酸消化率（AID）和标准回肠氨基酸消化率（SID），结果表明测定结果均高于中国饲料成分及营养价值表的推荐值。董文轩等[11]给三元杂交猪安装T 型瘘管，测定不同存储时间小麦的氨基酸表观回肠消化率，结果表明储存时间显著影响小麦的氨基酸表观回肠消化率，储存1年后的小麦对生长猪的营养价值最佳，随着储存时间越长，其营养价值越低。Fuller等[12]试验结果显示PVTC测定的大麦蛋白与干燥奶制品两种原料蛋白质消化率均高于STC。Morz等[7]将SICV与PVTC两种方法进行了比较，发现SICV测定的干物质、有机物和粗蛋白的回肠末端表观消化率比PVTC 的测定值低，这与SICV 法收集全部回肠食糜与不使用指示剂密切相关。其能被业内接受并认可的另一原因是测值准确性较高，从表1可知，3处不同数据来源所报道的玉米和豆粕的回肠表观氨基酸消化率，张晋辉等[13]和Sauer等[14]报道的玉米和豆粕两类饲料原料的必需氨基酸消化率处于中国饲料数据库的推荐值范围之内，其中，Sauer等[14]的试验结果显示玉米的必需氨基酸消化率均高于张晋辉等[13]的测定值，然而二者在测定豆粕的必需氨基酸消化率中，除缬氨酸和苯丙氨酸相差较大外，其他必需氨基酸消化率值非常接近，总体而言，Sauer 等[14]的试验结果与中国饲料数据库的推荐值更为接近，表明瘘管法测定氨基酸消化率是可普遍应用且结果是可信的。

表1 猪饲料回肠氨基酸表观消化率比较（%）

由于T型瘘管法在应用中存在无法忽视的弊端，如必须使用指示剂，在很大程度上影响了试验结果的准确性。存在一种趋势是两种瘘管法被用来测定谷物和豆粕复合饲料的消化率时，观察到两种瘘管技术之间存在差异，但评定单一饲料时，二者几乎没有差异[15]。专家学者们将桥型和T型瘘管法进行了比较试验，如印遇龙[16]的试验结果表明，测定单一植物性饲料和粗蛋白含量较低的混合饲粮的蛋白质和氨基酸消化率时，T型瘘管法的测定结果高于桥型瘘管法；而测定高含量粗蛋白饲粮时结果相反，且T型瘘管法变异系数＞25%，桥型瘘管法＜8%，表明与T型瘘管法相比，桥型瘘管法测定结果更加准确。综上所述，桥型瘘管法是全取样法，不需要使用指示剂，测定结果更加准确，但手术操作和术后护理难度较大；而T型瘘管法（尤其是简单T型瘘管法）对动物本身的生理状态影响较小，且手术操作和术后护理都更为简单，但也存在测定值不够精确、需要使用指示剂等问题。迄今为止，在实际日粮营养成分分析中，应用得最广泛的还是简单T型瘘管法，在具体的应用中试验人员还需根据自己的试验要求和目的等因素选择合适的方法。

2.2 影响瘘管法测定氨基酸消化率的因素分析

2.2.1 饲粮因素

研究表明，对进行瘘管手术后恢复良好的荷术动物来说，瘘管的插入对动物肠道干物质和能量的消化率并无影响[17-18]，换言之，安装瘘管本身对动物肠道消化率影响很小，影响消化率的因素应着重考虑饲粮或动物等其他因素更为实际。

饲粮因素是影响瘘管法测定氨基酸消化率的重要因素之一，饲料原料的氨基酸组成比例、粗蛋白水平、抗营养因子及饲料成熟度等因素导致不同饲料蛋白质消化率存在差异[19]。研究表明，粗蛋白水平较高的饲粮对生长猪的饲喂价值更高[19]，含乳成分饲粮的氨基酸表观消化率高于大麦饲粮，其中以赖氨酸表观消化率差异最大[12]。Adeola 等[21]研究发现，饲粮粗蛋白含量从68 g/kg提高到214 g/kg时，多种必需氨基酸和非必需氨基酸的AID 呈线性增加，与Fan 等[22]的试验结果相同。刘正群[23]给阉公猪回肠末端安装简单T型瘘管探讨不同粗蛋白水平是否对生长猪AID和SID产生影响，试验结果表明不同粗蛋白水平显著影响生长猪氨基酸（AA）的AID，多数AA 的AID 会随着粗蛋白水平的提高呈线性增加，其增加值可从3.70%[酪氨酸（Tyr）]变化到38.25%[脯氨酸（Pro）]，而对生长猪的SID 并无显著影响。Otto 等[24]研究表示，饲粮粗蛋白水平在满足动物需求的基础上继续提高时，多数氨基酸的AID会呈线性降低，说明粗蛋白的添加水平需在适宜范围，并不是越高越好。Köhler[25]表示饲粮干物质的消化率影响氨基酸的消化率，采用IRA 和PVTC法收集试验猪3、9、12周的回肠食糜，结果表明，IRA-猪的干物质表观回肠消化率显著高于PVTC-猪，但除Thr外，IRA-猪其他必需氨基酸消化率均低于PVTC-猪。另有文献报道，饲粮中粗纤维浓度对猪饲粮氨基酸消化率的影响同样不可忽视，一般来说，饲粮纤维浓度越高，蛋白质和氨基酸的消化率越低，原因在于饲料提供的纤维成分抑制了消化酶的活性以及消化酶与肠道食糜内营养物质的酶促反应[26]。Dilger 等[27]研究发现，中性洗涤纤维含量每增加1%，饲粮中粗蛋白和氨基酸的AID 降低0.3%～0.8%。李铁军等[28]和Zhao 等[29]认为饲粮中纤维的来源和成分比饲粮纤维的含量对回肠内源氨基酸损失的影响更大。

2.2.2 动物因素

不同动物品种、体重和生理阶段的回肠氨基酸消化率均有所不同。Mariscal-Landin 等[30]研究发现，断奶仔猪的氨基酸回肠基础内源损失显著高于生长猪。Presto 等[31]研究发现，体重为25.9 kg 的生长猪的内源氨基酸损失高于体重93.2 kg的生长猪。亦有报道称不同生长阶段的猪氨基酸消化率也存在差异，如生长阉公猪Lys 消化率的范围在52.27%～84.31%[32]，而断奶仔猪Lys 消化率的范围在79.92%～88.62%[33]。王磊[34]对比了长白猪、大白×太湖二元杂交猪（以下简称大太二杂猪）和太湖猪的饲粮养分消化率，结果表明，大太二杂猪对饲粮干物质、粗蛋白、粗脂肪以及能量的消化率都高于长白猪和太湖猪，而长白猪和太湖猪在饲粮干物质、粗蛋白和总能上的消化率并无显著差异。其中缘由可追溯到出生初期，观察到大太二杂猪胃的相对重量和小肠长度都极显著高于长白猪和太湖猪，可能是由于杂交优势表达出了大太二杂猪优于其他猪种的营养消化率和生活力。但Stein 等[35]表示，动物的年龄、体重和生理状态对单位干物质采食量的回肠内源氨基酸损失影响很小。

2.2.3 取样方法

不同瘘管体系的取样方法导致结果差异较大，T型瘘管法需结合指示剂法，指示剂法本身存在分析方法上的误差，在取样时会有过高比例的三氧化二铬（Cr2O3）和没有完全消化的食糜微粒涌出，导致消化率测定不准确[3]，是T 型瘘管法的弊端。研究表明指示剂种类会影响猪氨基酸的内源损失，且与饲粮类型有联合作用[36]，Jagger等[37]和Favero等[38]也表示不同纤维水平和添加植酸酶与指示剂种类之间也存在相互作用。另外，在不同时间段收集的食糜，其Cr2O3、氨基酸以及蛋白质的含量差异很大，使得测值变异系数加大，Granam等[39]认为动物食糜排出具有昼夜间歇的特点，通过简单T型瘘管法很难一次性收集到有代表性的样品。刘成玲等[40]对此问题进行了进一步研究，发现使用T型瘘管法收集生长猪回肠末端食糜及指示剂的流量在日内采样时间上有显著差异，连续收集16 h的回肠食糜发现，总能与粗蛋白的总量占全天流经回肠末端的68%以上，且这一比例日间差异不显著，Cr2O3在日间相对稳定，回收率在69%以上，说明16 h收集的食糜具有一定的代表性。

2.2.4 其他

直接法和差异法计算饲粮氨基酸消化率结果存在差异，Oliveira 等[41]试验结果表示，用直接法计算玉米和小麦的Trp，两者的AID没有区别；但使用差异法计算，小麦的Trp的AID显著高于玉米。此外，试验过程中出现食糜渗漏、瘘管堵塞以及术后护理不当导致猪死亡等问题均会影响试验的进程和结果。

3 结语

T型瘘管法具有取样方便、手术过程简单、术后易护理等优势，但取样代表性差、测定结果不够精确；桥型瘘管法测定更精确，但手术过程和术后护理更困难、对手术人员要求很高，操作或护理不当易造成猪死亡。在实际测定猪回肠末端氨基酸消化率时，简单T型瘘管法的应用更加广泛，如果长期研究高纤维饲粮氨基酸消化率，宜选择桥型瘘管法，但试验成本更高。