黄连须多糖水浴提取工艺优化及体外抗氧化活性研究

田谷正男，胡 莹，蒋凤珍，朱希强，姜 宁,2，刘晓鹏,2*

(1.湖北民族大学 生物科学与技术学院，湖北 恩施 445000；2.生物资源保护与利用湖北省重点实验室，湖北 恩施 445000)

黄连(CoptischinensisFranch.)为毛茛科黄连属多年生草本植物，主要药用部位是干燥根茎.《中华人民共和国药典》记载的方剂中有120多种含有黄连及其炮制品[1]，研究证明多糖为黄连的主要活性成分之一[2-3]，具有降血糖[4]、抗氧化[5]、神经保护[6]、抗炎[7]等诸多药理活性.

自从1956年衰老自由基学说提出后，各种抗氧化剂一直是研究的热点，而天然的抗氧化剂具有稳定性好、安全、无副作用、易获取等特点，因此从绿色天然的植物中提取，特别是从药食同源的植物中提取抗氧化剂具有极大的研究价值.以黄连须为研究对象，对黄连须多糖提取工艺进行优化，对其体外抗氧化活性进行探究，为黄连副产物的高效开发利用、提高黄连附加值提供实验基础.

1 材料与方法

1.1 材料

黄连须(购于恩施市太山庙天惠黄连专业合作社)，60 ℃烘干，粉碎过60目筛，备用.

1.2 实验试剂

硫酸，三氯甲烷，L-抗坏血酸，H2O2，国药集团化学有限公司；无水乙醇，正丁烷，武汉市中天化工有限责任公司；蒽酮，DPPH，ABTS，三吡啶三吖嗪(2,4,6-Tris(2-pyridyl)-s-triazine,TPTZ)，菲啰嗪，源叶生物科技有限公司.

1.3 仪器与设备

TDL-40B离心机，TDL-80ZB离心机，上海安亭科学仪器厂；HH-8数显恒温水浴锅，常州智博仪器制造有限公司；752紫外可见分光光度计，上海菁华科技有限公司；全波长酶标仪，赛默飞世尔科技(中国)有限公司.

1.4 方法

1.4.1 黄连须粗多糖含量测定 称取一定量的黄连须粉末，水浴提取后，4 000 r/min离心20 min，收集上清液，此过程重复2次，合并上清液并加入无水乙醇至无水乙醇的体积分数达80%，4 ℃过夜，然后4 000 r/min离心20 min，取沉淀，用80 ℃的去离子水使其复溶后用Sevag法[8]去蛋白，再加4倍体积的无水乙醇醇沉.醇沉沉淀经去离子水复溶，即为黄连须粗多糖溶液.采用硫酸蒽酮比色法[9]，测其多糖含量，按照以下公式计算黄连须粗多糖得率:

式中：A为多糖得率(%)；ρ为测定样品液的质量分数(mg/mL)；V为提取体积(mL)；N为稀释倍数；m为黄连须粉末质量(mg).

1.4.2 黄连须多糖提取工艺的优化

1) 单因素实验.① 不同提取温度对多糖得率的影响.称取一定量的黄连须粉末按料液比1∶20(g/mL)，分别在50、60、70、80、90 ℃水浴下提取2 h；按1.4.1方法提取多糖并计算得率.② 不同提取时间对多糖得率的影响.称取一定量的黄连须粉末按料液比1∶20(g/mL)，分别在80 ℃水浴下提取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h；按1.4.1方法提取多糖并计算得率.③ 不同料液比对多糖得率的影响.称取一定量的黄连须粉末按料液比1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40(g/mL)，在80 ℃水浴下提取2 h；按1.4.1方法提取多糖并计算得率.④ 不同提取次数对多糖得率的影响.称取一定量的黄连须粉末按料液比1∶20(g/mL)，在80 ℃水浴下2 h分别提取1、2、3、4次，按1.4.1方法提取多糖并计算得率.

2) 正交实验.根据单因素实验结果，采用L9(34)正交表设计正交实验，正交实验设计因素与水平见表1.

表1 正交因素水平表Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiment

3) 验证实验.按照正交实验优化的工艺进行验证实验，验证实验重复3次，以验证工艺的稳定性和可靠性.

1.4.3 黄连须粗多糖体外抗氧化活性的测定

1) DPPH自由基清除力的测定.将Vc配制成摩尔浓度分别为88.72、44.36、22.18、11.09、5.54、2.77和1.39 μmol/L的溶液，根据改良马超等[10]的方法，测定其DPPH自由基清除率，以Vc摩尔浓度为横坐标，DPPH自由基清除率为纵坐标，绘制标准曲线并计算回归方程；同时检测黄连须粗多糖2.000 0、1.000 0、0.500 0、0.250 0、0.125 0、0.062 5、0.031 2 mg/mL质量浓度范围的DPPH自由基清除率，以黄连须粗多糖质量浓度为横坐标，DPPH自由基清除率为纵坐标，绘制量效曲线并计算回归方程.以Vc当量表示黄连须粗多糖DPPH自由基清除力的大小.DPPH自由基清除率计算公式为

式中：B1为DPPH自由基清除率(%)；As为待测样品与DPPH溶液混合的吸光度值；Ac1为待测样品与无水乙醇混合的吸光度值；A01为蒸馏水或缓冲液与DPPH溶液混合的吸光度值.

2) ABTS自由基清除力的测定.根据张岩等[11]测定方法，稍作改良.将88.72 μmol/L摩尔浓度的Vc溶液2倍系列稀释，测定1.39～88.72 μmol/L范围内的ABTS自由基清除率，以Vc摩尔浓度为横坐标，ABTS自由基清除率为纵坐标，绘制标准曲线并计算回归方程；按照相同方法检测黄连须粗多糖在1.000 0、0.500 0、0.250 0、0.125 0、0.062 5、0.031 2、0.015 6 mg/mL质量浓度范围的ABTS自由基清除率，绘制曲线、计算线性回归方程.以Vc当量表示黄连须粗多糖ABTS自由基清除能力的大小.ABTS自由基清除率计算公式为

式中：B2为ABTS自由基清除率(%)；At为待测样品与ABTS溶液混合的吸光度值；Ac2为待测样品与无水乙醇或缓冲液混合的吸光度值；A02为蒸馏水或缓冲液与ABTS溶液混合的吸光度值.

3) 羟自由基清除力的测定.根据Wang等[12]测定方法，稍作改良.分别检测2.84、1.42、0.71、0.35、0.18、0.09、0.04 mmol/L Vc溶液和2.000 0、1.000 0、0.500 0、0.250 0、0.125 0、0.062 5、0.031 2 mg/mL黄连须粗多糖溶液的羟自由基清除率，以Vc摩尔浓度、黄连须粗多糖质量浓度为横坐标，羟自由基清除率为纵坐标，绘制曲线并计算回归方程.以Vc当量表示黄连须粗多糖羟自由基清除力大小.羟自由基清除率计算公式为

式中：B3为羟自由基清除率(%)；Ar为加入样品的吸光度值；Ac3为样品本身的吸光度值；A03为不加样品的吸光度值.

4) 总还原力的测定.根据刘进杰等[13]测定方法，稍作改良.以Vc为阳性对照，检测354.87、177.43、88.72、44.36、22.18、11.09、5.55 μmol/L Vc溶液的总还原力，以Vc摩尔浓度为横坐标，在波长700 nm处有总还原反应特征吸收峰，因此以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线并计算回归方程；再测定黄连须粗多糖质量浓度为2.000 0、1.000 0、0.500 0、0.250 0、0.125 0、0.062 5、0.031 2 mg/mL溶液的总还原力，以黄连须粗多糖质量浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制曲线并计算回归方程.以Vc当量表示黄连须粗多糖总还原力的强弱.

5)黄连须粗多糖铁离子还原抗氧化能力(FRAP)的测定.根据张韫等[14]测定方法，稍作改良.测定摩尔浓度为177.44、88.72、44.36、22.18、11.09、5.54、2.77 μmol/L Vc溶液作为阳性对照，以Vc摩尔浓度为横坐标，在波长593 nm处有铁离子还原反应特征吸收峰，因此以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线并计算回归方程；再测定黄连须粗多糖质量浓度分别为2.000 0、1.000 0、0.500 0、0.250 0、0.1250 0、0.062 5、0.031 2 mg/mL溶液的铁离子还原抗氧化能力，以黄连须粗多糖质量浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制曲线并计算回归方程.以Vc当量表示黄连须粗多糖铁离子还原抗氧化能力的大小.

6) 亚铁离子螯合能力的测定.根据Agrawal等[15]测定方法，稍作改良.以EDTA-2Na为阳性对照，分别检测摩尔浓度为185.90、92.95、46.47、23.14、11.62 μmol/L EDTA-2Na溶液的亚铁离子螯合能力，以EDTA-2Na摩尔浓度为横坐标，亚铁离子螯合力为纵坐标，绘制标准曲线并计算回归方程；再测定黄连须粗多糖2.000、1.000、0.500、0.250、0.125 mg/mL溶液的亚铁离子螯合能力，以黄连须粗多糖质量浓度为横坐标，亚铁离子螯合力为纵坐标，绘制曲线并计算回归方程.以EDTA-2Na当量表示亚铁离子螯合能力的大小.亚铁离子螯合力计算公式为

式中：B4为亚铁离子螯合力(%)；A1为加入样品的吸光度值；A2为不加菲咯嗪的吸光度值；A04为不加空白吸光度值.

2 结果与分析

2.1 黄连须多糖提取单因素实验结果

2.1.1 提取温度对黄连须粗多糖提取的影响 提取温度对黄连须多糖得率的影响见图1.由图1可知提取温度会显著影响多糖得率(P<0.01).随着温度的不断提高，黄连须的多糖提取率随之递增，在提取温度为90 ℃时，提取率最高达1.13%；这是因为提取温度较低，黄连须细胞内的多糖分子运动速率较低，导致大量多糖分子无法溶出;随着温度的提升，细胞内的分子热运动逐渐加强，使大部分的多糖分子溢出细胞，温度的提高也加快了黄连须细胞的渗透性增加，从而导致多糖的提取率提高.根据实验结果选取70、80、90 ℃为后续正交实验的3个水平.

注：小写字母代表α=0.05显著水平上的差异. 注：小写字母代表α=0.05显著水平上的差异. 图1 提取温度对黄连须多糖得率的影响 图2 提取时间对黄连须多糖得率的影响Fig.1 Effect of extraction temperature on the yield of coptidis radix fibrous polysaccharides Fig.2 Effect of extraction time on the yield of coptidis radix fibrous polysaccharides

2.1.2提取时间对黄连须粗多糖提取的影响 提取时间对黄连须多糖提取的影响见图2.由图2可知，当时间增加到一定程度时多糖得率明显增加；在2.5 h后多糖得率趋于稳定，此时的多糖分子已经大部分溶出.在提取时间为1～3 h期间内，虽然得率有所增加，无显著性差异(P>0.01)，提取2.5 h多糖得率只比提取2.0 h多糖得率高出0.07%，综合考虑提取效率和能量损耗性，因此选取1.0、1.5、2.0 h为后续正交实验的3个水平.

2.1.3 料液比对黄连须粗多糖提取的影响 料液比对黄连须粗多糖提取的影响见图3，提取料液比显著影响多糖得率(P<0.05).当料液比为1∶5(g/mL)时多糖提取率最低，主要是提取溶剂过少，导致细胞内大量的多糖分子无法有效溶出；当料液比增加到1∶10(g/mL)时，多糖提取率显著提高.当料液比为1∶10、1∶20、1∶30(g/mL)时，多糖得率无显著差异；当料液比为1∶40(g/mL)时多糖得率反而下降，主要是因为多糖分子在1∶30(g/mL)时已经大部分溶出，这时增加提取溶剂体积，并没有更多的多糖分子溶出，反而溶剂体积增加导致多糖的额外损失，故黄连须多糖的提取率下降.根据实验结果选取1∶10、1∶20、1∶30(g/mL)为后续正交实验的3个水平.

注：小写字母代表α=0.05显著水平上的差异. 注：小写字母代表α=0.05显著水平上的差异.图3 料液比对黄连须多糖得率的影响 图4 提取次数对黄连须多糖得率的影响 Fig.3 Effect of material-liquid ratio on the yield of coptidis radix fibrous polysaccharides Fig.4 Effect of extraction times on the yield of coptidis radix fibrous polysaccharides

2.1.4 提取次数对黄连须粗多糖提取的影响 由图4可知多糖提取得率与次数呈正相关.提取2次和3次多糖得率并没有显著变化(P>0.05)，但均与提取1次有显著差异.提取4次虽与提取2次、3次有差异显著，但从得率比较只比前两次分别增加了0.17%、0.18%，综合实验周期、效率和能耗考虑，故选取1、2、3次为后续正交实验的3个水平.

2.1.5 正交实验结果分析 正交实验结果如表2所示.根据正交实验结果进行极差分析，得出影响黄连须多糖提取得率因素主要顺序为A>D>B>C，即提取温度>提取次数>提取时间>料液比；最优组合为A3B2C3D3，即提取温度90℃、料液比1∶20(g/mL)、提取时间2 h、提取3次.根据方差分析(表3)结果F值得出因素主次与极差分析的结果一致；且提取温度、提取时间、料液比、提取次数对多糖得率均有显著性差异.考虑生产成本与能耗，C3的K值仅比C2大0.07，故选取最优提取时间为C2，即1.5 h，故最终的最优组合为A3B2C2D3，即提取温度90 ℃、料液比1∶20 (g/mL)、提取时间1.5 h、提取次数3次.

表2 正交实验结果Tab.2 Results of orthogonal experiment

表3 正交实验结果方差分析Tab.3 Results of analysis of variance of orthogonal experiment

2.1.6 验证实验结果 根据正交实验优化的工艺进行验证实验，黄连须多糖得率为(1.64±0.02)%.提取得率高于正交实验的任一组合，证明该提取工艺稳定有效.

2.2 黄连须粗多糖体外抗氧化活性测定结果

2.2.1 黄连须粗多糖的DPPH自由基清除力 Vc在1.39～88.72 μmol/L摩尔浓度范围内，DPPH自由基清除率与摩尔浓度呈正相关，且线性关系良好，决定系数R2=0.968 9，线性方程为y=0.666 3x+38.361(图5)；由图5可知，黄连须粗多糖在0.031 2～2.000 0 mg/mL的质量浓度范围内，DPPH自由基清除率与质量浓度呈线性相关，R2=0.945 1，线性方程为y=28.029x+23.607.计算得黄连须粗多糖DPPH自由基清除能力为(24.46±2.12)μmol Vc当量/mg.

图5 DPPH自由基清除率 图6 ABTS自由基清除率 Fig.5 DPPH free radical scavenging rate Fig.6 ABTS free radical scavenging rate

2.2.2 黄连须粗多糖的ABTS自由基清除力 图6为Vc摩尔浓度与ABTS自由基清除率的量效关系.由图6可知，当摩尔浓度在1.39～88.72 μmol/L范围内时，Vc的ABTS自由基清除率与摩尔浓度呈线性关系，线性方程为y=0.786 8x+11.643，R2为0.997 5；黄连须粗多糖的ABTS自由基清除率与质量浓度呈线性关系(浓度0.015 6～1.000 0 mg/mL)，线性方程为y=62.976x+17.039，决定系数为R2=0.990 9(图6).计算得黄连须多糖ABTS自由基清除能力为(101.63±10.62)μmol Vc当量/mg.

2.2.3 黄连须粗多糖的羟自由基清除力 由图7可知，当Vc摩尔浓度在0.04～2.84 mmol/L范围内时，Vc摩尔浓度与羟自由基清除率呈正相关，决定系数为R2=0.994 1，线性方程为y=27.101x+25.824.图7为黄连须多糖质量浓度与羟自由基清除率的量效关系，当黄连须多糖质量浓度为0.031 2～2.000 0 mg/mL时线性关系良好，线性方程为y=27.01x+11.293，决定系数为R2=0.985 6，计算得黄连须多糖羟自由基清除能力为(0.47±0.17)mmol Vc当量/mg.

图7 羟自由基清除率 图8 总还原力Fig.7 Hydroxyl radical scavenging rate Fig.8 Total reducing power

2.2.4 黄连须粗多糖的总还原力 当Vc摩尔浓度在5.54～354.87 μmol/L范围内时，Vc摩尔浓度与总还原能力为正相关，且有良好线性关系，线性方程为y=0.002 7x+0.114 4，决定系数为R2=0.993 7(图8).由图8可知当黄连须多糖质量浓度在0.031 2～2.000 0 mg/mL范围内时，量效关系良好，且质量浓度与总还原能力呈正相关，决定系数为R2=0.995 7，线性方程为y=0.131 3x+0.116 4.计算得黄连须多糖总还原力为(52.56±2.99)μmol Vc当量/mg.

2.2.5 黄连须粗多糖的铁离子还原抗氧化能力(FRAP) 图9为Vc摩尔浓度与铁离子还原抗氧化能力的量效关系.由图可知，当Vc摩尔浓度范围为2.77～177.44 μmol/L时，Vc摩尔浓度与铁离子还原抗氧化能力呈正相关，线性关系良好，线性方程为y=0.001 3x+0.270 4，决定系数为R2=0.999 1.当黄连须多糖质量浓度在0.031 2～2.000 0 mg/mL范围内时，由图9可知黄连须多糖质量浓度与铁离子还原抗氧化能力呈线性关系，线性方程为y=0.056x+0.267 1，决定系数为R2=0.987 2.计算得黄连须多糖铁离子还原抗氧化能力为(45.80±4.05)μmol Vc当量/mg.

图9 Fe3+还原抗氧化力 图10 亚铁离子螯合力 Fig.9 Fe3+ reducing antioxidant power Fig.10 Ferrous ion chelating power

2.2.6 黄连须粗多糖的亚铁离子螯合能力 EDTA-2Na摩尔浓度与亚铁离子螯合能力量效关系见图10.由图10可知,当EDTA-2Na摩尔浓度范围在11.62～185.90 μmol/L内，亚铁离子螯合能力与EDTA-2Na摩尔浓度线性关系良好，呈正相关，线性方程为y=0.479 7x+15.398，决定系数为R2=0.959 5.当黄连须粗多糖质量浓度在0.125～2.000 mg/mL范围内，亚铁离子螯合能力与黄连须多糖质量浓度具有线性关系，线性方程为y=24.469x+25.424，决定系数为R2=0.977 9(图10).计算得黄连须粗多糖亚铁离子螯合能力为(77.55±9.53)μmol EDTA-2Na当量/mg.

3 讨论

近年来，黄连多糖的研究越来越受到重视.吕秀梅等[16]采用效应面法优化黄连多糖的提取工艺，黄连多糖得率为35.43 mg/g；吴玉娟等[17]研究了3种提取液对黄连多糖进行提取，在生药中最高含量为1.42%；姜爽等[18]优化了黄连多糖回流提取法的最优工艺，平均得率为1.52%.上述研究均采用黄连块茎为研究对象.作为黄连副产品的黄连须，目前研究主要集中在生物碱上[19-21]，而对黄连须多糖鲜有研究.本研究以黄连须为研究对象，优化了黄连须多糖的提取工艺，多糖得率达(1.64±0.02)%，高于黄连多糖.

随着自由基的深入研究，广大学者致力于寻找天然的、无毒的抗氧化剂，多糖类化合物在此领域具有良好的活性.李云等[22]从羟自由基、超氧阴离子和DPPH自由基3个方面评价了4个不同组分的黄连多糖体外抗氧化活性，结果表明其具有一定的抗氧化活性.隋玉等[23]以IC50为计算方法，从DPPH自由基、ABTS自由基、羟自由基清除能力3个角度评价了元蘑多糖的体外抗氧化活性，实验结果表明其对羟自由基清除能力IC50达到0.64 mg/mL.姜爽等[18]研究了黄连多糖的体外抗氧化活性，结果表明黄连多糖对超氧阴离子自由基、羟自由基和DPPH自由基具有一定的清除作用.本实验从6个体外抗氧化活性指标全方位评价了黄连须多糖的体外抗氧化能力，结果表明，黄连须多糖具有较强的体外抗氧化活性；且与目前多数以半抑制浓度(IC50)表示抗氧化能力大小相比，本实验采取阳性对照摩尔当量的表示方法可定量表示体外抗氧化活性的强弱，为定量添加抗氧剂黄连须多糖提供了数据参考.

由于黄连对生长环境的苛刻要求，且从栽培到收获需3～4年，药用黄连与市场关系一直处于供不应求状态，但在采收过程中黄连须根往往被药农遗弃，黄连须根被利用的程度很低，据统计湖北省利川市每年会有大约500 t的黄连须根被遗弃.研究结果显示黄连须中的多糖含量高于黄连块茎，且在体外抗氧化实验中证实黄连须多糖有较强的ABTS自由基清除率和羟自由基清除率，分别达到(101.63±10.62)μmol Vc当量/mg、(0.47±0.17)mmol Vc当量/mg，对DPPH自由基清除率、铁离子还原抗氧化能力、亚铁离子螯合力、总还原力也具有一定活性，说明黄连须多糖具有较高的体外抗氧化活性.因此，该研究为黄连须的高效利用、变废为宝、增加收益奠定了有力基础.