天然抗氧化剂对鳄鱼油体外抗氧化活性的影响

傅丽君 ，王海燕 ，郑雅鸿 ，杨 磊 ，李华亮，丁玉梅

(1.福建省新型污染物生态毒理效应与控制重点实验室,福建 莆田 351100； 2.生态环境及其信息图谱福建省高校重点实验室,福建 莆田 351100； 3.莆田学院 新工科产业学院，福建 莆田 351100; 4.福建鼍龙实业有限责任公司,福建 厦门 361026)

鳄鱼全身都是宝，是现存最原始的动物之一。鳄鱼体内粗脂肪含量为3.5%～7.0%，鳄鱼油含有多达24种脂肪酸，其中不饱和脂肪酸含量在60%以上[1]。鳄鱼油脂肪酸组成与深海鱼油相似，富含二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)，具有较高的经济价值[2]。《本草纲目》记载，鳄鱼油主治“摩风及恶疮”，已被证实具有防冻伤、抗菌消炎等功效[3]。自2005年国家林业局批准了尼罗鳄、湾鳄和暹罗鳄3种鳄鱼列入54种可商业利用的野生动物以来[3]，鳄鱼油已广泛应用于化妆品、烫伤膏及消炎等产品的开发。如何更好地开发和利用鳄鱼资源是目前需要解决的问题。

油脂中不饱和脂肪酸稳定性差，极易氧化生成醛、酮类等有害物质，从而损伤机体并危害人类健康[4-5]，因此延缓鳄鱼油的氧化对其深加工和高值化利用尤为重要。目前，延缓油脂氧化的常用方法为添加抗氧化剂[6]。抗氧化剂作为一种外源性抗氧化物，可阻断或抑制油脂氧化过程的某一环节[7]，从而抑制油脂氧化。随着人工合成抗氧化剂的副作用被证实，油脂中添加高效、低毒、价廉的天然抗氧化剂成为研究热点。目前鲜见关于鳄鱼油抗氧化活性研究的相关报道。

本研究以前期精制鳄鱼油为原料，采用Schaal烘箱法，比较茶多酚(TP)、维生素E(VE)和植酸3种常用天然抗氧化剂对鳄鱼油的抗氧化效果，并优选出天然抗氧化剂，采用体外抗氧化试验，测定添加优选抗氧化剂的鳄鱼油对DPPH自由基、羟自由基、超氧自由基清除能力，还原能力和Fe2+螯合能力等抗氧化活性指标，旨在为天然抗氧化剂筛选及提升鳄鱼油抗氧化能力提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 原料与试剂

精制鳄鱼油,酸值(KOH)为(0.234±0.005)mg/g，过氧化值为(4.663±0.020)mmol/kg,由福建鼍龙实业有限责任公司提供。1，1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)，南京奥多福尼生物科技有限公司;水杨酸,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;邻苯三酚,国药集团化学有限公司;菲啰嗪,上海伊卡生物技术有限公司;植酸,浙江仁和生物科技有限公司;维生素E、维生素C(VC),上海源叶生物科技有限公司；茶多酚(TP)，无锡世纪生物科技有限公司。

1.1.2 仪器与设备

DHP-9052型电热恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；AEG-220型电子天平，日本岛津公司;KQ-250E型超声波清洗器,中国昆山超声仪器有限公司；HH-4型系列数显水浴锅，金坛市白塔新宝仪器厂；U-3900型紫外可见光分光光度计，日本日立公司；LD5-2A型离心机，北京医用离心机厂。

1.2 试验方法

1.2.1 不同抗氧化剂对鳄鱼油抗氧化效果的影响

采用Schaal烘箱法[8]测定鳄鱼油的氧化稳定性。取50.0 g鳄鱼油于烧杯中，分别添加0.02% 的TP、VE和植酸(先用约10 mL无水乙醇溶解)，搅拌混合均匀，敞口放置于(60±1)℃恒温干燥箱中，每隔12 h搅拌1次，间隔1 d取样按GB 5009.227—2016测定过氧化值。每组重复测定3次，并设空白对照(未添加抗氧化剂)，比较不同抗氧化剂对鳄鱼油抗氧化效果的影响。

1.2.2 DPPH自由基清除能力测定

分别将鳄鱼油及添加0.02%抗氧化剂的鳄鱼油用无水乙醇稀释成质量浓度分别为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mg/mL的样品，参照文献[9]的方法测定鳄鱼油的DPPH自由基清除率，以添加的抗氧化剂和VC作为阳性对照。

1.2.3 羟自由基清除能力测定

将鳄鱼油及添加0.02%抗氧化剂的鳄鱼油用无水乙醇稀释成质量浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL的样品，按文献[10]的方法测定鳄鱼油的羟自由基清除率，以添加的抗氧化剂和VC作为阳性对照。

1.2.4 超氧自由基清除能力测定

将鳄鱼油及添加0.02%抗氧化剂的鳄鱼油用无水乙醇稀释成质量浓度分别为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mg/mL的样品，参照文献[10]采用邻苯三酚自氧法测定鳄鱼油的超氧自由基清除率，以添加的抗氧化剂和VC作为阳性对照。

1.2.5 还原能力测定

将鳄鱼油及添加0.02%抗氧化剂的鳄鱼油用无水乙醇稀释成质量浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL的样品，参照文献[10]采用铁氰化钾法测定鳄鱼油的还原能力，以添加的抗氧化剂和VC作为阳性对照。

1.2.6 二价铁离子(Fe2+)螯合能力测定

将鳄鱼油及添加0.02%抗氧化剂的鳄鱼油用无水乙醇稀释成质量浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL的样品，参照文献[10]的方法测定鳄鱼油的Fe2+螯合能力，以添加的抗氧化剂和VC作为阳性对照。

1.2.7 数据统计与分析

采用Origin Pro 2019软件进行数据处理与统计，SPSS 25.0软件计算自由基清除率为50%时所需要的物质的质量浓度，即半数抑制率(IC50)。

2 结果与分析

2.1 不同抗氧化剂对鳄鱼油的抗氧化效果

过氧化值是评价油脂氧化程度的指标，一般过氧化值越大说明油脂的氧化程度越高。不同抗氧化剂对鳄鱼油的抗氧化效果见图1。

图1 不同抗氧化剂对鳄鱼油的抗氧化效果

由图1可看出，在烘箱储藏4 d内，空白对照组与各处理组的过氧化值均随时间的延长而升高，且空白对照组的过氧化值高于各处理组。在4～6 d时，空白对照组的过氧化值出现下降趋势，而各处理组的过氧化值仍表现为缓慢增长趋势，空白对照组的过氧化值显著低于植酸和VE处理组的，而高于TP处理组的。在添加量均为0.02%时，3种天然抗氧化剂对鳄鱼油的抗氧化效果表现为TP>VE>植酸。不同抗氧化剂的抗氧化效果存在差异可能是它们的结构、纯度及抗氧化机理等不同造成的，其中：植酸具有抗氧化、抗菌等活性，同时其磷酸基团能螯合金属离子[11]；TP因能使未成对电子离域而具有较强活性，既能通过清除自由基、螯合金属离子、抑制氧化酶活性等直接途径抑制油脂氧化，又能通过保护机体的内源性抗氧化酶而起到间接的抗氧化效果[12]；VE能够有效阻断脂质的过氧化连锁反应。综上，选取TP为抗氧化剂，研究鳄鱼油的体外抗氧化活性。

2.2 鳄鱼油对DPPH自由基的清除能力(见图2)

图2 鳄鱼油对DPPH自由基的清除能力

DPPH是十分稳定的以氮为中心的自由基，样品的DPPH自由基清除能力能反映其抗氧化活性[13]。由图2可知，添加TP的鳄鱼油对DPPH自由基的清除率在中低质量浓度(0～4.0 mg/mL)范围内急剧增长，在高质量浓度(4.0～6.0 mg/mL)范围内逐渐趋于稳定，此时DPPH自由基清除率达90%左右，且均高于鳄鱼油的，添加TP的鳄鱼油对DPPH自由基清除能力的IC50(0.874 mg/mL)是鳄鱼油(5.448 mg/mL)的约1/6。TP、VC对照组在低质量浓度(0～1.0 mg/mL)范围内，对DPPH自由基的清除率表现出急剧上升趋势，之后逐渐趋于平缓，最终DPPH自由基清除率达94%左右，添加TP的鳄鱼油在质量浓度为4.0～6.0 mg/mL时的DPPH自由基清除率与二者相当。上述结果表明，向鳄鱼油中添加TP可显著提高鳄鱼油对DPPH自由基的清除能力。这可能是由于TP在乙醇溶液中会进行电子转移反应，而在极性较低的鳄鱼油中进行H原子转移反应和电子转移反应，二者共同作用提高了鳄鱼油对DPPH自由基的清除能力[10]。

2.3 鳄鱼油对羟自由基的清除能力(见图3)

图3 鳄鱼油对羟自由基的清除能力

羟自由基是机体内反应性和破坏性极强的自由基，与活细胞许多成分反应，直接损伤各种生物大分子(核酸、蛋白质、脂质等)和生物膜(与细胞膜上的不饱和脂肪酸发生过氧化反应)，从而引起机体的损伤和衰老[14]。对羟自由基的清除能力是反映物质抗氧化活性的重要指标。由图3可知,在质量浓度为0～0.6 mg/mL范围内，鳄鱼油对羟自由基的清除率与其质量浓度呈良好的量效关系，其IC50为0.684 mg/mL。添加TP的鳄鱼油和TP、VC对照组在低质量浓度(0～0.1 mg/mL)范围内对羟自由基的清除率均表现出急剧上升趋势。添加TP的鳄鱼油在中质量浓度(0.1～0.3 mg/mL)范围内对羟自由基的清除率略有增长，在中高质量浓度(0.3～0.6 mg/mL)范围内对羟自由基的清除率趋于稳定，此时羟自由基清除率约为84%，其IC50为0.064 mg/mL，显著低于鳄鱼油(0.684 mg/mL)的。TP、VC对照组对羟自由基清除率在质量浓度为0.1～0.6 mg/mL范围内变化不大，其中:TP对羟自由基的清除率达77%左右，低于添加TP的鳄鱼油；VC对羟自由基清除率超过94%，高于添加TP的鳄鱼油；但TP与VC对羟自由基的清除率均高于鳄鱼油。

2.4 鳄鱼油对超氧自由基的清除能力(见图4)

图4 鳄鱼油对超氧自由基的清除能力

超氧自由基主要是通过Fenton反应产生，其具有强氧化和细胞毒性作用，能够有效杀灭病原微生物，但如果在体内大量聚集，会对人体健康产生危害，引起机体衰老，引发各项疾病[14]。对超氧自由基的清除能力是评价物质抗氧能力的重要指标之一。

由图4可知，添加TP的鳄鱼油对超氧自由基的清除率在中低质量浓度(0～3.0 mg/mL)范围内随其质量浓度的增加而快速增长，在中高质量浓度(3.0～6.0 mg/mL)范围内随质量浓度变化趋于稳定，此时超氧自由基清除率约为69%，其IC50为0.96 mg/mL。鳄鱼油在质量浓度为0～6.0 mg/mL范围内对超氧自由基的清除率随其质量浓度升高而上升，其IC50为4.53 mg/mL，高于添加TP的鳄鱼油的。TP和VC在质量浓度为0～1.0 mg/mL范围内对超氧自由基的清除率呈快速上升趋势，之后逐渐趋于平缓，此时TP对超氧自由基的清除率约为66%，与添加TP的鳄鱼油相当；VC对超氧自由基的清除率约为73%，高于添加TP的鳄鱼油和鳄鱼油。

2.5 鳄鱼油的还原能力(见图5)

图5 鳄鱼油的还原能力

采用铁氰化钾法利用分光光度计测定样品的还原能力，吸光度越大，代表样品还原能力越高[15]，抗氧化活性越强。由图5可知，在低质量浓度(0～0.1 mg/mL)范围内，添加TP的鳄鱼油和TP、VC对照组的还原能力接近，均高于鳄鱼油的。各处理组还原能力在低质量浓度范围增长明显，在质量浓度大于 0.1 mg/mL 时，随质量浓度增加还原能力增长速度渐缓，还原能力大小依次为VC>TP>添加TP的鳄鱼油>鳄鱼油。

2.6 鳄鱼油的二价铁离子(Fe2+)螯合能力(见图6)

图6 鳄鱼油的Fe2+螯合能力

Fe2+作为过渡金属离子，是促氧化剂，可以促进活性氧的产生，从而氧化一些脂质、蛋白质和细胞组分，对机体产生氧化损伤。Fe2+螯合能力的大小可以反映物质抗氧化活性的强弱，Fe2+螯合率越大，则抗氧化活性越强[14]。由图6可知：鳄鱼油的Fe2+螯合能力随其质量浓度的增加而升高，呈一定的量效关系；添加TP的鳄鱼油其Fe2+螯合能力随其质量浓度增加而快速增长，在0.5 mg/mL之后达到稳定，此时Fe2+螯合率在83%以上，其IC50为0.175 mg/mL，约是鳄鱼油的1/4。TP对照组与添加TP的鳄鱼油Fe2+螯合率变化趋势相似，但高于添加TP的鳄鱼油。VC对Fe2+螯合能力最大，在质量浓度为0～0.3 mg/mL 范围内Fe2+螯合率随其质量浓度的增加而快速增长，0.3 mg/mL后增长速度趋缓，最高约为92%，高于添加TP的鳄鱼油的。TP对金属离子具有很强的结合作用和沉淀功能[16]，因此经TP处理后显著提高了鳄鱼油的还原能力和Fe2+螯合能力。

3 结 论

采用Schaal烘箱法探明了添加天然抗氧化剂TP、VE和植酸对鳄鱼油氧化稳定性的影响，发现三者对鳄鱼油抗氧化效果强弱为TP>VE>植酸。添加TP后鳄鱼油对DPPH自由基、羟自由基及超氧自由基清除能力显著提高，Fe2+螯合能力和还原能力也增强，表明TP能有效切断引起鳄鱼油自动氧化的自由基链式反应，提高鳄鱼油的抗氧化活性。