驴源枯草芽孢杆菌分离鉴定及生物学特性

齐鹏飞 ， 吴艳秋，3， 岳寿松， 张 伟， 李 强边 斐， 于金慧， 王永军， 苏晓轶， 张 燕

（1.山东省农业科学院畜牧兽医研究所，山东济南 250100；2.山东省农业科学院农作物种质资源研究所，山东济南 250100；3.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春 130124；4.山东省畜牧总站，山东济南 250100；5.济南市动物疫病预防与控制中心，山东济南 250022；6. 淄博市农业综合行政执法支队，山东淄博 255020）

驴隶属于马属动物， 是耐粗饲单胃草食动物（刘宇等，2019）， 也是我国独具特色和优势的畜牧品种（李杰等，2019）。随着人们对阿胶、驴肉等驴制品需求量增加，养驴业逐渐向规模化、集约化发展。 规模化驴场多选用玉米青贮（包括全株玉米青贮）、花生秧、豆秸、干玉米秸、麦秸、麦糠、谷秸、花生壳、豆荚皮等粗纤维含量高的饲草料，搭配一定比例的精料饲喂驴，粗纤维的消化吸收率偏低（姜慧新等，2019）。 芽孢杆菌属细菌是动物饲料添加剂中的重要菌属，除蜡样芽孢杆菌和炭疽芽孢杆菌外， 大多数对哺乳动物无害（Amin等，2019）。 芽孢杆菌属细菌能分泌各种酶类、抑菌物质和维生素等代谢产物，促进营养物质消化和吸收，抑制病原菌生长，维持肠道菌群平衡，增强动物机体免疫（Amin 等，2019；Elshaghabee 等，2017；李春凤等，2013）。 芽孢杆菌的芽孢能抵抗各种逆境（胃酸、高温、高盐、紫外线等）（Olmossoto 等，2020；Elshaghabee 等，2017； 李春凤等，2013），已成为广泛应用于鱼虾（Olmos-soto 等，2020）、肉 鸡（Xi 等，2019；谢 文 惠，2018；Li 等，2016）、猪（孟祥宇，2018）等渔业与畜牧养殖业生产的饲料添加剂。

益生菌具有宿主特异性， 理想益生菌菌株应来源于本源动物（Cui 等，2017）。 驴源益生菌研究很少， 到目前为止， 有驴源的1 株短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）（刘宇等，2019）、2 株乳酸菌[分别为干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）和罗伊氏乳杆菌（L.reuteri）]（王卓等，2021；刘宇等，2017）和1株屎肠球菌 （Enterococcus faecium）（左立康等，2021）的相关报道。本试验旨在分离筛选具有良好益生性能的驴源芽孢杆菌， 为研发绿色安全的驴用微生态制剂提供理论和应用参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 主要试剂 酵母粉、 蛋白胨购自Oxoid 公司；琼脂粉、牛肉浸粉购自北京索莱宝科技有限公司；氯化钠、刚果红、羧甲基纤维素钠等购自生工生物（上海）股份有限公司；细菌基因组DNA 提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；细菌微量生化反应管、 药敏纸片均购自杭州滨和微生物试剂有限公司；T5 Super PCR Mix 购自青岛擎科梓熙生物技术有限公司；DNA 凝胶回收试剂盒购自OMEGA 公司。

1.1.2 主要培养基配方 LB、 牛肉膏营养培养基、蛋白酶选择培养基、淀粉酶选择培养基和纤维素酶选择培养基配制参照李龙等（2017）的方法。

1.1.3 指示菌株 大肠杆菌（Escherichia coli）、沙门氏菌（Salmonella typhimurium）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）均由聊城大学黑毛驴研究院惠赠。

1.2 菌株分离

1.2.1 样品来源 在无棣县、 禹城市和东阿县3个规模化驴场分别用无菌袋采集3 头2 岁左右健康驴新鲜粪便，置于干冰中带回实验室，并于-80 ℃保存，直至菌株筛选。

1.2.2 菌株筛选 分别称取10 g 驴粪样品，置于含90 mL 无菌生理盐水的锥形瓶内（瓶内预置适量无菌玻璃珠），置于摇床180 r/min 充分振荡30 min，85 ℃水浴处理20 min，依次10 倍梯度稀释，吸取100 μL 合适梯度样品涂布LB 平板，置于37 ℃培养24 ～48 h， 根据菌落形态挑取芽孢杆菌单菌落，并继续划线培养2 ～3 次，直至菌落纯化。

1.3 抑菌活性检测 挑取分离纯化菌株，接种于营养肉汤培养基，37 ℃振荡过夜培养，1%接种于新鲜的肉汤培养基培养24 h， 发酵液用0.22 μm针孔滤膜过滤备用。将适量活化金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌分别注入适温LB 固体培养基，混匀后倒平板。将发酵液进行牛津杯（直径D0为8 mm） 抑菌试验， 观察、 记录抑菌圈直径D（mm），通过抑菌带（D-D0）大小判定菌株抑菌活性。 筛选到2 株芽孢菌对金黄色葡萄球菌有强抑制作用，分别命名为LV1 和LV2。

1.4 革兰氏染色和生化鉴定 革兰氏染色观察LV1 和LV2 菌体形态。 生化试验参照《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常用细菌系统鉴定手册》生化鉴定指标进行。

1.5 16S rDNA 序列分析 参照TIANGEN 细菌基因组DNA 提取试剂盒方法提取LV1 和LV2 总DNA， 采用通用引物7F： 5′-CAGAGTTTGATCCTGGCT -3′ 和 1540R： 5′ -AGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′ PCR 扩增16S rDNA 片段，产物测序由北京擎科生物科技有限公司完成。 所得序列与GenBank 数据库序列进行BLAST 比对分析，并采用Neighbor-Joining 法与相似度较高序列构建系统发育树。

1.6 产酶能力 将LV1 和LV2 菌株点接于蛋白酶选择培养基、 淀粉酶选择培养基和纤维素酶选择培养基，37 ℃培养24 h。 在蛋白酶选择培养基上直接观察菌落周围水解圈情况； 在纤维素酶选择培养基上先滴加1 g/L 刚果红溶液染色30 min，再滴加1 mol/L NaCl 溶液，观察菌落周围水解圈情况；在淀粉酶选择培养基上滴加碘液，观察菌落周围水解圈情况。

1.7 酸和胆盐耐受性 用盐酸将LB 液体培养基pH 调至2.0、3.0 和4.0， 用牛胆盐配制质量分数分别为0.1%、0.2%和0.3% 的LB 培养基。 将100 μL培养24 h 的菌液分别接种于9.9 mL 不同pH 液体培养基和不同胆盐浓度的培养基中， 置于37 ℃培养4 h。 两处理分别于0 h 和4 h 时进行菌落计数，记录为N0和NT，并根据以下公式计算存活率。

1.8 耐药性检测 采用K-B 纸片琼脂扩散法测定， 根据抑菌圈大小判定目标菌株对市售常见抗生素药品敏感性。

2 结果

2.1 体外抑菌试验 抑菌试验结果获得两株对金黄色葡萄球菌具有强抑制作用的芽孢菌，分别命名为LV1 和LV2，抑菌圈直径分别达26 mm 和28 mm，但对大肠杆菌和沙门氏菌无抑菌活性（图1）。

图1 菌株LV1 和LV2 对3 种指示菌体外抑菌试验

2.2 菌落形态 LV1 和LV2 菌落和芽孢形态见图2，两菌株菌落近圆形或边缘不规则，表面粗糙有褶皱，呈灰白色或淡黄色。 LV1 和LV2 革兰氏染色后可见两端钝圆的阳性杆状，芽孢椭圆形，位于细胞末端或中央，具有芽孢杆菌属特征。

图2 LV1 和LV2 菌落及菌体形态

2.3 生化试验结果 LV1 和LV2 菌株生理生化鉴定结果见表1，参照《伯杰氏细菌鉴定手册》和《常用细菌系统鉴定手册》生化鉴定指标，初步判断LV1 和LV2 可能为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。

表1 菌株LV1 和LV2 生化试验结果

2.4 16S rDNA 测序和进化分析 由图3 可知，LV1 和LV2 菌株16S rDNA PCR 扩增产物大小约1500 bp，与预期结果一致。 由图4 遗传进化比对结果显示，LV1 和LV2 16S rDNA 序列完全一致，与参考菌株B.subtilis（登录号：NR112629） 和B.subtilis（登录号：CP020102）遗传距离最小，亲缘关系最近，初步判定菌株为枯草芽孢杆菌。结合菌落形态、生理生化试验结果与16S rDNA 分析结果，可确定LV1 和LV2 为枯草芽孢杆菌。

图3 16S rDNA PCR 扩增结果

图4 基于16S rDNA 基因序列采用邻接法构建菌株LV1 和LV2 的系统进化树

2.5 胞外酶活性 由图5 可知，在淀粉酶选择型培养基、 纤维素酶选择性培养基和蛋白质选择性培养基上，LV1 和LV2 菌株菌落周围都产生清晰的水解圈，说明LV1 和LV2 都能水解淀粉、羧甲基纤维素钠和蛋白质。 其中，LV1 和LV2 降解淀粉透明圈直径分别为11 mm 和14 mm，菌落直径分别为6 mm 和4 mm， 透明圈直径/菌落直径分别为1.83 和3.5； 降解羧甲基纤维素钠透明圈直径分别为20 mm 和19 mm， 菌落直径分别为7 mm 和8 mm， 透明圈直径/菌落直径分别为2.86和2.34；降解蛋白透明圈直径分别为18 mm 和19 mm，菌落直径分别为8 mm 和6 mm，透明圈直径/菌落直径分别为2.25 和3.17。 LV2 对淀粉和蛋白的降解能力大于LV1，而LV1 对纤维素的降解水平略大于LV2。

图5 菌株LV1 和LV2 在3 种水解酶选择性培养基的水解特性

2.6 耐酸和耐胆盐试验 由图6 可知，LV1 和LV2 都具有很好的耐酸和耐胆盐活性，随着pH 升高和胆盐浓度降低存活率逐渐升高。 LV1 和LV2对酸性环境耐受性强，在pH 为2.0 时，存活率分别为89.9%和112.6%。 LV1 和LV2 对胆盐环境也具有很强的耐受性，在胆盐含量为0.3% 时，存活率分别达到70.2%和94.2%。LV1 和LV2 两株芽孢杆菌对酸性环境和胆盐环境都具有很好的耐受性，尤其LV2 菌株对酸性和胆盐的耐受性更强。

图6 菌株LV1 和LV2 对酸性和胆盐环境的耐受性

2.7 药敏试验 药敏试验按抑菌圈直径大小作为判定敏感度高低的标准。 由表2 可知，LV1 和LV2 菌株对本试验所用9 种抗生素卡那霉素、新霉素、四环素、庆大霉素、氨苄西林、头孢拉定、头孢氨苄、氟罗沙星、环丙沙星都敏感。

表2 药敏试验结果

3 讨论

益生菌能够提高动物免疫力和生产性能，具有无毒、无污染、无残留、绿色环保等优点，成为一种良好的抗生素替代品。 与双歧杆菌、乳酸菌、肠球菌、酵母菌等益生菌相比，芽孢杆菌具有很大优势（Mingmongkolchai 等，2018）。 一方面，芽孢杆菌可形成坚硬、耐逆性强的内生孢子，能抵御各种极端环境（低pH、高温、高浓度胆盐等），另一方面，内生孢子存活期长 （Mingmongkolchai 等，2017；Cutting，2011）。 枯草芽孢杆菌是目前研究较为透彻的一类菌，也是一种理想的多功能益生菌，其孢子能耐受动物消化道逆境， 养殖中能提高饲料转化率， 抑制病原菌的生长 （Olmos-soto 等，2020；Mingmongkolchai 等，2018；Li 等，2016）。本研究通过对筛选目标菌株生物学特性测定， 获得产酶性能良好、对酸性和胆盐有较强耐受性、对金黄色葡萄球菌有强抑制作用的LV1 和LV2 菌株，综合生化试验结果与16S rDNA 测序分析， 确定两株菌都为枯草芽孢杆菌，为后续应用提供了便利条件。

驴养殖业一直以来都属小众产业， 驴源益生菌的研究较少。 刘宇等（2019）报道的短小芽孢杆菌LV2 隶属芽孢杆菌属，能产纤维素酶（透明圈直径13 mm，菌落直径6 mm），有较好抑制金黄色葡萄球菌活性（抑菌圈直径20 mm，牛津杯直径8 mm）。 与短小芽孢杆菌LV2 菌株相比，本研究筛选的两株枯草芽孢杆菌LV1 和LV2，具有更好的抑菌性和产酶性能， 对金黄色葡萄球菌抑菌圈直径分别达为26 mm 和28 mm （牛津杯直径8 mm）， 产纤维素酶活性更好 （透明圈直径分别为20 mm 和19 mm， 菌落直径分别为7 mm 和8 mm），并能同时产淀粉酶（透明圈直径分别为11 mm 和14 mm，菌落直径分别为6 mm 和4 mm）和蛋白酶（透明圈直径分别为18 mm 和19 mm，菌落直径分别为8 mm 和6 mm），此外，LV1 和LV2对试验用9 种抗生素都敏感， 传播耐药基因的潜在风险小。枯草芽孢杆菌LV1 和LV2 同时具备了抑菌、产多种底物降解酶、耐酸和胆盐能力强、安全性较高的特性，具有很大的应用潜力。

抗生素曾在动物疫病防控、生长发育、饲料转化等方面发挥着重要作用，但抗生素的滥用，导致细菌耐药性（特别是超级细菌）、兽药药残等问题出现， 对畜禽产品质量安全和环境安全造成严重威胁（Mingmongkolchai 等，2018）。 随着科学技术发展和生活水平提高， 人们对抗生素滥用的负面影响也越来越重视，欧盟、美国、日本等国家相继禁止在饲料中添加抗生素，我国也于2020 年1 月1 日起， 退出除中药外的所有促生长类药物饲料添加剂品种，自2020 年7 月1 日起，饲料生产企业停止生产含有促生长类药物饲料添加剂（中药类除外）的商品饲料（农业农村部第194 号公告）。因此， 寻找用于畜禽养殖业疾病防控和促生长的抗生素替代品成为近年来研究热点。 本研究筛选的两株枯草芽孢杆菌不仅具有降解纤维素、 淀粉和蛋白质性能， 还具有很强的抑制金黄色葡萄球菌的性能，且无耐药性，避免菌株在动物肠道内抗性基因水平转移，是潜在的微生态制剂候选菌株。枯草芽孢杆菌为我国饲料添加剂名录（2013）（中华人民共和国农业部公告第2045 号） 可添加菌种，相对安全，但由于菌株的特异性，其动物安全性及动物体内益生作用还需进一步研究。