湖南地方猪精液冷冻技术应用研究

刘海林 ，罗子燕 ，朱建军 ，邓运江 ，曾勇波 ，周元中 ，张翠永 ，朱立军 ，燕海峰

（1.湖南光大牧业科技有限公司，湖南 长沙 410131；2.湘西自治州畜牧水产事务中心，湖南 吉首 416000；3.宁乡市动物疫病预防控制中心，湖南 长沙 410600；4.湖南省畜牧兽医研究所，湖南 长沙 410131）

随着我国经济的迅速发展，消费者对肉质的要求与日俱增；同时“卡脖子”的种业难题等让国家对地方猪品种非常重视，湖南地方猪中的宁乡猪、沙子岭猪、湘西铁骨猪和大围子猪均列入地方保护品种范围，并对其进行大量品种改良工作。

非洲猪瘟等烈性传染病的肆虐对地方猪品种造成了毁灭性的打击；为加快对地方猪保种和品种改良工作，许多省份开展了地方猪精液冷冻技术的研发；但目前尚无统一的生产标准，且冻精的解冻后活力偏低、畸形率高，从而导致母猪配怀率和产仔率低等；因此，需要从冻精制作的原精处理、冷冻和解冻等各个环节进行优化处理，提高猪冻精质量。

本研究以湖南地方猪精液为素材，对冻精制作的精液稀释、冷冻方法以及冻精解冻方法三个方面进行探讨，为湖南地方猪精液冷冻保种库的建立奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

常温稀释粉（AndroPro® Plus）；冷冻稀释粉（AndroheP®CryoGuard）；Equex-Paste；解冻剂（AndroheP CryoGuard Thaw）均为法国米尼图提供。

视频温控显微镜（HW-39A，江西新怡光学仪器有限公司）；恒温磁力搅拌器（78HW-1，金坛市医疗仪器厂）；电子天平（ES-500HA，长沙湘平科技发展有限公司）；恒温水浴锅（HH-SI，金坛市医疗仪器厂）。程序冷冻仪（法国米尼图公司）。

1.2 试验设计

1.2.1 探讨精液稀释方法

取2岁左右成年湘西铁骨种公猪3头，每头重复采精6次，每次采集间隔5 d。每头每次采精的精液平均分为3份（编号为001、002、003）。二次稀释法：是指精液在15℃降温至4℃的过程中，用冷冻保护剂进行二次稀释。三次稀释法：是在采集精液后到离心前，用常温稀释液进行1∶1稀释；之后再由冷冻保护剂进行二次稀释。001不进行常温稀释（二次稀释法）；002和003分别在原场地和试验室进行常温稀释（三次稀释法）。

1.2.2 探讨精液冷冻方法

取2岁左右成年、体质健康、精液品质稳定的宁乡猪、大围子猪、沙子岭猪和湘西铁骨种公猪各6头，每头重复采精3次，每次采集间隔4～5 d。

液氮喷入法：将平衡后的细管迅速转移到程序冷冻仪中，降温冷冻程序为：5℃降至-10℃时间为3 min，-10℃降至-100℃的时间为2.5 min，-100℃降至-140℃时间为2 min，最后在-140℃下装入袋中，做好标记，最后快速投入液氮中。

液氮距离一步法：将平衡后的细管迅速转移到小型泡沫箱内不同高度的泡沫架上（泡沫箱规格：长30 cm，宽22 cm，高20 cm），泡沫架上距离液氮面3 cm，冷冻8 min后，迅速投入液氮中。

液氮距离多步法：将平衡后的细管迅速转移到自动升降冷冻装置上，分别为上1 cm、上0 cm、下1 cm、下2 cm和下3 cm。 冷冻后迅速投入液氮中。

1.2.3 探讨冻精解冻方法

随机选择宁乡猪、大围子猪、沙子岭猪和湘西铁骨猪合格冻精，在不同时间段进行5次测试，每个试验组每次3个重复。解冻方法为：38℃30 s、42℃25 s、47℃20 s、52℃15 s、57℃10 s和62℃5 s。

1.3 采精与预处理

采用手握法收集射精中间部分的精液，过滤胶质部分后，按试验设计进行预处理。选择稀释活力超过0.5的进行下一步操作。

1.4 冷冻保护液的制备

冷冻保护液I：将44 g冷冻稀释粉溶解于400 mL预热的蒸馏水中，加入100 mL鸡蛋黄，拌匀；冷却至17℃ 后待用。

冷冻保护液Ⅱ：将40.7 g冷冻稀释粉完全溶解于370 mL预热的蒸馏水中，加入100 mL鸡蛋黄，拌匀；再加30 mL甘油，拌匀；再加入5 mL Equex Paste，拌匀；冷却至4℃后待用。

1.5 离心、稀释、平衡与装管

将预处理后的精液转移到离心瓶中，在17℃和每分钟转速2 750的条件下离心10～12 min，弃上清。按预设的冻精密度计算好冷冻保护液添加量后，加入冷冻保护液I，混匀，放入盛有蒸馏水（17℃）的烧杯中，在4℃的冰箱中平衡1.5～2h。

将冷冻保护液Ⅱ缓慢地加到4℃的精液中，轻轻晃动来混合均匀。

在4℃条件下，15 min内完成每头份精液的装管（0.25 mL），封口；再转移到4℃的冷冻冰柜中，平衡3 h。

1.6 冷冻

试验一采用液氮喷入法，试验二采用液氮喷入法、液氮距离一步法和液氮距离多步法。

1.7 解冻

从液氮罐中迅速取1支细管，放入38℃水浴锅中晃动30 s（试验一和试验二均采用此解冻方法），剪去空气端，注入1 mL预热的解冻液中，摇匀放入水浴锅（38℃）静置1 min后检测活力。

1.8 活力、畸形率和顶体完整率的测定

通过米尼图精子分析系统选取样品中3处不同视角来测量精液活力。

采用姬姆萨染色法测定精子畸形率和顶体完整率。

1.9 统计分析

数据用SPASS25.0统计软件进行差异显著性检验和单因素方差分析比较，结果用平均值±标准差表示（mean±sem）。

2 结果与分析

2.1 不同稀释方法对铁骨猪精液冷冻效果的影响

不同稀释方法下，铁骨猪精液冷冻前活力差异不显著（P＞0.05）。

采用三次稀释法的铁骨猪精液冷冻后活力极显著高于二次稀释法试验组（P＜0.01）；其中采用实验室稀释的精液冷冻后活力为63.4%，高于原场稀释的53.8%，但差异不显著（P＞0.05）。

不同稀释方法下，铁骨猪精液冷冻后畸形率差异极显著（P＜0.01）；二次稀释法畸形率极显著高于三次稀释法试验组（P＜0.01），三次稀释试验组之间的畸形率差异不显著（P＞0.05）。

二次稀释法下，铁骨猪精液冷冻后的顶体完整率要极显著低于三次稀释法试验组（P＜0.01）。见表1。

表1 不同稀释方法对铁骨猪精液冷冻效果的影响（%，n=6）

2.2 不同稀释和冷冻方法对湖南地方猪精液冷冻后活力的影响

由表2可知，不同冷冻方法下，二次稀释法的冻后活力均显著低于三次稀释法试验组（P＜0.05）；不同的冷冻方法下，原场和实验室稀释的试验组冻后活力均无显著差异（P＞0.05）。

表2 不同稀释和冷冻方和对湖南地方猪精液冷冻后活力的影响（%，n=8）

二次稀释法下，不同冷冻方法的试验组之间冻后活力无显著差异（P＞0.05）；在三次稀释法下，采用液氮喷入法的冻后活力均显著高于距离一步法和距离多步法的试验组（P＜0.05），距离一步法和距离多步法的试验组之间无显著差异（P＞0.05）。

2.3 不同解冻方法对湖南地方猪精液解冻效果的影响

由表3可见，从冻精活力来分析，52℃15 s的试验组最高，为34.5%，其次是38℃30 s，为33.6%，两者差异不显著（P＞0.05）；62℃5 s最低为23.2%，极显著低于52℃15 s和38℃30 s试验组（P＜0.01），冻精活力随解冻温度的升高有先上升后下降的趋势。38℃30 s试验组的畸形率为13.26%，极显著低于其他5组（P＜0.01）。顶体完整率方面，38℃30 s和42℃25 s组极显著高于其他4组（P＜0.01），两者差异不显著（P＞0.05）；62℃5 s试验组最低，为28.1%，极显著低于其他5组；当解冻温度超过42℃后，随着解冻温度的升高，顶体完整率有明显的下降趋势。

表3 不同解冻方法对湖南地方猪精液解冻效果的影响（%，n=15）

3 讨论

3.1 不同的稀释方式对铁骨猪精液冷冻效果的影响

目前的猪精液冷冻技术研究中，原精处理主要有二次稀释法和三次稀释法，稀释的目的是尽可能减少甘油和温度变化等对精子的损伤。

试验一中发现，不同稀释方法下铁骨猪冷冻前活力无显著差异（P＞0.05），本次试验由于原场地设备不够，没有检测原精活力，因而无法判断不同稀释方法对原精采集到实验室稀释后精子活力的变化情况，这需要进一步的研究。

本次试验中，采用三次稀释法的试验组冻后活力均极显著高于二次稀释试验组（P＜0.01），说明在精液离心前进行稀释可提高其冻后活力，这可能是本次试验的冻精制作点离公猪场较远，运输时间长，此外运输中的晃动等会降低精子活力；因而通过1∶1稀释来增加精子营养供给和精子运动缓冲余地，从而有效维持精子活力。

三次稀释法中，采用实验室稀释的精液冷冻后活力要高于原场稀释的试验组，但差异不显著，这可能与原场的稀释设备和环境条件落后等有关。

3.2 不同稀释和冷冻方法对湖南地方猪精液冻后活力的影响

试验二发现，在液氮喷入法和距离一步法冷冻方法下，二次稀释法的冻后活力均极显著低于三次稀释法的试验组（P＜0.01），在距离多步法法下，二次稀释法的冻后活力均显著低于三次稀释法的试验组（P＜0.05），而冻前活力均无显著差异（P＞0.05）；这说明二次稀释法对冷冻过程的精子活力降低有影响，这进一步验证了试验一的结果，其原因可能是精子的顶体结构等在冷冻前就遭到了一定程度的破坏，在超低温冷冻过程中加速了精子的凋亡，从而导致解冻后的活力下降。

在猪精液冷冻过程中，降温速率最为关键，在4～5℃降至1℃要缓慢，让卵黄、甘油等冷冻保护剂与精液充分融合，同时避免精子发生不可逆的冷休克现象；但在危险温区（0至-60℃），需要迅速降温，促进精液快速形成玻璃化结构，从而降低精子损伤比例。目前猪冻精技术中的降温方式主要是采用液氮熏蒸，其中有喷入法（控制喷入的液氮量来进行分段降温） 和距离法两种（控制样品离液氮面的高度来实现降温） ，前者设备昂贵且液氮消耗量大，但操作方便，自动化程度高；后者装置简单廉价且消耗液氮少，但目前没有国家统一标准，对每个环节的操作经验要求较高。

本试验二中采用的液氮距离法分一步法和多步法，国内许多研究以一步法来制作冻精，操作相对简单，但不能精确控制降温速度；多步法可结合超低温温度仪来控制精液冷冻降温速率，这与液氮喷入法的原理一致。

在二次稀释法下，不同冷冻法试验组之间冻后活力无显著差异（P＞0.05），这说明冷冻法没有影响精子冷冻过程中的活力变化，进一步证实精子损伤发生在原精采集到冷冻前这一过程中。在原场地的三次稀释法下，液氮喷入法的冻后活力极显著高于液氮距离法（P＜0.01），这说明三次稀释法与液氮喷入法结合对精子结构的保护产生有益的组合效应，这需要进一步验证。在三次稀释法下，距离一步法和距离多步法的试验组之间无显著差异（P＞0.05），距离多步法均略低于距离一步法试验组，这与本次试验条件与制作材料均有一定的关系。

3.3 不同解冻方法对湖南地方猪精液解冻效果的影响

适当的解冻温度能让精液快速通过冰晶化形成的危险温度区，从而降低对精子的损伤；适宜解冻时间让精液液化后，温度缓慢上升到10～17℃之间，从而延长精子活力的维持时间。国内外研究表明，解冻温度主要集中在温水（30～40℃）和高温水（50～70℃）两个区间，与剂量、解冻时间和精子密度等均具有一定的相关性。

目前国内商用化猪（杜长大等外来品种）冻精主要有0.25 mL和0.5 mL两种剂型，精子密度为4亿/mL，解冻方法为：0.25 mL，38℃20 s；0.5 mL，50℃15～16 s。地方猪品种的解冻方法差异性很大：梅山猪，0.25 mL细管，38℃30 s；版纳微型猪0.5 mL细管，40℃6 s；广东小耳花猪0.5 mL细管，50℃15 s；巴马香猪，55℃10 s，这些研究表明，解冻温度与解冻时间呈反比的关系；目前国内关于解冻密度与解冻温度和时间的关系尚无相关报道。

本试验从保种角度考虑，选择高于商品猪密度（4亿/mL），达到≥6.6亿/mL；结合牛冻精的成功制作经验，选择0.25 mL规格的细管；同时参考以上国内两个解冻温区和解冻时间，设定6组解冻参数：38℃30 s、42℃25 s、47℃20 s、52℃15 s、57℃10 s和62℃5 s。

综合本次检测的活力、畸形率和顶体完整率3个指标，确定以38℃30s的试验组解冻后精液质量最佳。

4 结论

本研究在同等条件下，探讨不同稀释、冷冻和解冻方法对湖南地方猪精液冷冻效果的影响。研究结果表明，湖南地方猪冻精的最佳制作方法为：采用三次稀释法（实验室稀释）处理精液，选择液氮喷入法制作冻精，用38℃30 s的解冻方法进行0.25 mL细管冻精的解冻。