13 种杀菌剂对猕猴桃溃疡病菌的室内抑菌及混配效果测定*

李 黎，潘 慧，李文艺，邓 蕾，陈美艳，钟彩虹

（中国科学院猕猴桃产业技术工程实验室，中国科学院植物种质创新与特色农业重点实验室，中国科学院种子创新研究院，中国科学院武汉植物园，湖北 430074）

猕猴桃细菌性溃疡病（kiwifruit bacterial canker，简称溃疡病）是一种严重威胁猕猴桃产业发展的毁灭性病害，致病性强、传播快、根除难。2020 年，经申请人团队调研发现，该病在我国陕西、四川、广西、贵州及湖南等省份均已发生，累计感病面积超过百万亩，平均病株率超过40%，特别是商品价值最高、栽培面积最大的黄肉和红肉品种遭受危害尤其严重，死树、毁园情况频发，溃疡病已成为我国猕猴桃产业发展的最大限制因素[1-2]。近年来，国内已有大量研究通过室内抑菌试验和田间试验比较了不同杀菌剂对猕猴桃溃疡病的防效。部分药剂被认为具有较好的防效，如中生菌素、可杀得3000、四霉素、叶枯唑、噻霉酮及溴硝醇等[3-8]。本文对已报道有效的13 种常用杀菌剂进行了统一条件下的室内抑菌效果测定及混配药剂的增效作用分析，以期获得防效较好的药剂组合，为猕猴桃溃疡病防治及农药减施增效提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试病菌：丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种（Pseudomonas syringaepv.actinidiae，简称Psa）C48菌株，分离自湖南常德东山峰农场的高致病菌株。

供试的13 种猕猴桃溃疡病常用防治药剂：2%春雷霉素水剂，华北制药集团爱诺有限公司；0.15%四霉素（梧宁霉素）水剂，辽宁微科生物工程股份有限公司；47%春雷王铜可湿性粉剂，日本北兴化学工业株式会社；46%可杀得3000 水分散粒剂，美国杜邦公司；3%中生菌素可湿性粉剂，福建凯立生物制品有限公司；86.2%铜大师水分散粒剂，挪威劳道克斯公司；33.5%喹啉铜悬浮剂，浙江海正化工股份有限公司；30%琥胶肥酸铜可湿性粉剂，齐齐哈尔四友化工有限公司；80%乙蒜素乳油，开封大地农化生物科技有限公司；20%叶枯唑可湿性粉剂，湖北蕲农化工有限公司；80%波尔多液可湿性粉剂，通州正大农药化工有限公司；45%代森铵水剂，湖北双吉化工有限公司；30%碱式硫酸铜悬浮剂，保定农药厂。

1.2 方法

1.2.1 13 种杀菌剂对溃疡病菌的抑菌率测定

（1）药剂质量浓度设定。基于已发表文献推荐的最佳田间使用方法，设定各药剂的稀释浓度：2%春雷霉素水剂500 倍液，0.15%四霉素水剂600 倍液，47%春雷王铜可湿性粉剂500 倍液，46%可杀得3000 水分散粒剂1 500 倍液，3%中生菌素可湿性粉剂800 倍液，86.2%铜大师水分散粒剂1 000 倍液，33.5%喹啉铜悬浮剂1 500 倍液，30%琥胶肥酸铜可湿性粉剂300 倍液，80%乙蒜素乳油4 000 倍液，20%叶枯唑可湿性粉剂600 倍液，80%波尔多液可湿性粉剂400 倍液，45%代森铵水剂150 倍液，30%碱式硫酸铜悬浮剂300 倍液。用KB 液体培养基将药剂稀释至相应浓度备用（10 mL 甘油，1.5 g K2HPO4，20 g 胰蛋白胨Oxoid，去离子水1 L）。

（2）菌悬液的制备及抑菌率测定。刮取C48病菌于50 mL KB 液体培养基三角瓶中，置于28 ℃、150 r/min 的摇床中培养24 h。采用紫外分光光度计法，配制浓度OD600为0.2 的菌悬液，取1 mL 接种于含相应浓度药剂的50 mL KB 培养液中（另加入160µL 1 mol/L MgSO4）。然后，将三角瓶置于28 ℃、180 r/min 的摇床中培养3 d；以不加药剂的KB 培养液作对照，每个处理3 次重复。随后，分别从对照及各药剂处理的菌悬液中取2 mL 于10 mL 离心管中8 000 r/min 离心10 min，去上清，取沉淀，并加入2 mL 无菌水，振荡，重悬菌体。以2 mL 无菌水作参比调零，将2 mL 含有不同药剂处理后的菌悬液置于比色皿中，记录OD600值，计算各处理药剂的抑菌率。

抑菌率（%）＝［（OD2-OD1）/OD2］×100

其中OD1代表各药剂处理的OD 值，OD2代表KB 培养液对照的OD 值。

1.2.2 7 种杀菌剂二元混配对溃疡病菌的抑菌率测定

将抑菌率排列在前7 位的防治药剂按照体积比进行1∶1 二元混配，共设置21 个组合，按照1.2.1方法计算对应的生长抑菌率。

1.2.3 3 种杀菌剂三元混配对溃疡病菌的抑菌率测定

基于农药混配原则，对筛选得到的3 种最高效且可混配药剂（春雷霉素∶四霉素∶乙蒜素）按体积比设置1∶1∶1、2∶1∶1、1∶2∶1、1∶1∶2共4个配比，根据1.2.1方法计算对应的生长抑菌率。

1.2.4 3 种高效杀菌剂对溃疡病菌的单剂毒力测定

设定3 种药剂的质量浓度梯度，2%春雷霉素水剂：112.5、225、450、900、1 800 mg/L；0.15%四霉素水剂：48、66、88 mg/L；80%乙蒜素乳油：26、38、42、46 mg/L。分别将各药剂用KB 液体培养基稀释到所需质量浓度备用，各浓度重复3 次。根据1.2.1 方法，测定3 种药剂不同质量浓度梯度处理的OD 值，求出生长抑菌率。同时，计算各药剂对病菌的有效抑制中质量浓度EC50值及EC95值；以药剂质量浓度值为x，菌株生长抑菌率值为y，建立不同药剂质量浓度对菌株的毒力回归直线方程，计算相关系数r。

1.2.5 4 种混配药剂对溃疡病菌的联合毒力测试

在单剂毒力测定的基础上，将乙蒜素∶春雷霉素∶四霉素按体积比设置1∶1∶1、2∶1∶1、1∶2∶1、1∶1∶2 共4 个配比，按上述方法确定混配药剂对菌株的生长抑制率、EC50值及EC95值，各浓度重复3 次。计算混配剂的共毒系数CTC，评价混配药剂的协同增效作用。

毒力指数TI＝（标准药剂EC50/供试药剂EC50）×100

混配剂实际毒力指数ATI＝（标准药剂EC50/混配制剂EC50）×100

混配剂理论毒力指数TTI＝单剂A 的TI×PA＋单剂B的TI×PB

PA 和PB 分别为混配剂中有效成分的百分含量。

共毒系数CTC＝（混配剂实际毒力指数ATI/混配剂理论毒力指数TTI）×100

增效作用判断：CTC≥120 具有增效作用，80＜CTC＜120 为相加作用，CTC≤80 为拮抗作用。

2 结果与分析

2.1 13 种杀菌剂对溃疡病菌的抑菌率

将13 种常用防治药剂进行室内抑菌率分析，发现其中7 种药剂对溃疡病防效较高，分别为80%乙蒜素乳油4 000 倍液、0.15%四霉素水剂600 倍液、2%春雷霉素水剂500 倍液、86.2%铜大师水分散粒剂1 000 倍液、3%中生菌素可湿性粉剂800 倍液、46%可杀得3000 水分散粒剂1 500 倍液及45%代森铵水剂150 倍液。前5 种药剂的抑菌率高于50%，其中80%乙蒜素的平均抑菌率高达92.56%，0.15%四霉素及2%春雷霉素的平均抑菌率分别为85.64%及69.34%，不论单剂或者混配使用均具有非常强的防治应用前景。其他6 种药剂47%春雷王铜可湿性粉剂500 倍液、30%琥胶肥酸铜可湿性粉剂300 倍液、80%波尔多液可湿性粉剂400 倍液、30%碱式硫酸铜悬浮剂300 倍液、20%叶枯唑可湿性粉剂600倍液及33.5%喹啉铜悬浮剂1 500 倍液对溃疡病菌的抑制效果不明显，不适用于溃疡病的防治（表1）。

表1 13 种常用细菌杀菌剂对溃疡病菌的室内抑制效果

2.2 7 种杀菌剂二元混配对溃疡病菌的抑菌率

为初步分析混配药剂是否可提高药剂的防治效率，将抑菌率排列在前7 位的药剂按照体积比进行1∶1 二元混配，共得到21 个混配组合，具体混配抑制效果见表2。研究结果发现：乙蒜素与多种药剂混配后抑菌率上升，乙蒜素单剂的抑菌率为92.56%，与代森铵、铜大师、四霉素、春雷霉素、可杀得3000 混配后抑菌率分别上升至96.32%、93.75%、93.61%、93.41%及93.09%，但与中生菌素混配抑菌率却下降至83.11%。四霉素除与乙蒜素具有良好的混配效果外，与可杀得3000、春雷霉素及铜大师混配后抑菌率也有所上升，分别从单剂的85.64%提高至95.91%、92.49%及86.27%，但不适宜与中生菌素、代森铵混配。春雷霉素与乙蒜素、四霉素、可杀得3000、中生菌素及代森铵混配后抑菌率均有所上升，分别从单剂的69.34%提高至93.41%、92.49%及82.80%、80.93%及71.33%，但不适合与铜大师进行混配。由此说明，农药混配不可随意进行，需根据试验结果确定最佳混配组合才能达到减施增效的目的。

表2 21 种二元混配药剂对溃疡病菌的室内抑制效果

2.3 3 种杀菌剂及三元混配对溃疡病菌的单剂或联合毒力

由于可杀得3000、铜大师为铜制剂，呈碱性，代森铵呈中性或弱碱性，而其他常规农药呈酸性，因此不适宜进行混配。基于2.2 的结果及药剂成分、酸碱度及混配原则等多方面考虑，最终确定运用乙蒜素、春雷霉素、四霉素进行不同比例的三元混配。为进一步确认混配药剂的增效作用，首先，对单剂进行毒力测试，分别得到3 种药剂的EC50值、毒力回归直线方程，计算相关系数r、EC50值及95%置信限。结果表明，3 种药剂的EC50值及EC95值与平均抑菌率趋势一致，抑菌效果依次为乙蒜素＞四霉素＞春雷霉素（表3）。

表3 溃疡病菌对乙蒜素、春雷霉素、四霉素的敏感性

随后，测试了4 种不同比例的乙蒜素、春雷霉素、四霉素混配药剂的共毒参数，发现4 种不同比例混配组合的CTC 值均大于120，表现为增效作用。其中当混配体积比为1∶1∶2 时抑菌率达99.14%，CTC 值高达247.567 0，为最佳混配比例（表4）。

表4 三元混配比例药剂对溃疡病菌的抑制效果及共毒系数

3 讨论与结论

近10 年来，溃疡病在各主产国持续暴发，造成了巨大的经济损失，尽快找到最佳的溃疡病防治方法已成为全球猕猴桃产业最迫切的需求。国内外对溃疡病的防治主要依赖硫酸链霉素及铜制剂，但2011 年开始硫酸链霉素逐步停止使用，铜制剂也证实会导致溃疡病菌耐药性增强[9]。目前，国内外的溃疡病用药仍处在摸索阶段，尚未开发出在各主产区均防效明显的绿色、高效防治药剂。本文对13种前期已报道的溃疡病防治药剂进行了统一条件下的抑菌效果评价，筛选出7 种抑菌率相对较高的药剂，其中80%乙蒜素乳油4 000 倍液、0.15%四霉素水剂600 倍液及2%春雷霉素水剂500 倍液3 种单剂对溃疡病的抑菌效果最好。

乙蒜素系大蒜提取物，是一种低成本、高效、内吸、低毒、低残留的植物源仿生结构的绿色农药，能抑制多种病原真菌或细菌生长[10]。高蓬明等[11]发现30%乙蒜素对猕猴桃溃疡病菌有一定抑菌效果；胡容平等[12]证实80%乙蒜素室内抑菌效果明显优于其他9 种药剂，稀释400 倍喷雾的田间防效达到68.77%，灌根＋涂干防效达到71.41%。本研究结果显示乙蒜素单剂对溃疡病菌的室内抑菌率达到92.56%。乙蒜素及其配套使用方法在猕猴桃溃疡病防治方面具有非常好的应用前景和推广价值。

四霉素为不吸水链霉素梧州亚种的发酵代谢产物，含有多种抗菌素，杀菌谱广，已证实对26种植物病原菌均有极强的杀灭作用。黄露等[13]发现0.3%四霉素对溃疡病的田间防效可达到71.06%。阳廷密等[14]通过室内毒力测试、田间枝干病斑涂抹及叶片喷雾试验，发现0.15%四霉素对溃疡病的防效在80%以上。焦红红[15]证实四霉素对溃疡病菌的室内杀菌效果优于其他30 种农药，且在活体嫁接苗及田间的防效均十分稳定。本研究结果发现，四霉素单剂对溃疡病菌的抑菌率仅略低于乙蒜素，达到85.64%，对溃疡病具有较好的防治效果。

春雷霉素是由小金放线菌产生的一种生物杀菌剂，具有较强的内吸性，兼具预防和治疗作用，可有效用于防治蔬菜、瓜果和水稻等作物的多种细菌和真菌性病害。张锋等[16]分析发现单独使用春雷霉素对猕猴桃溃疡病菌的抑菌效果并不明显。鄢明峰[8]研究证实四霉素对溃疡病的抑菌作用高于春雷霉素。本研究结果也显示，春雷霉素单剂对溃疡病菌的抑菌率略低于乙蒜素及春雷霉素，为69.34%。因此，总体而言，本研究的单剂抑菌结果与前人研究一致。

在防治猕猴桃溃疡病的混配药剂开发方面，周艳丽[17]及曲子瑞[18]发现，乙蒜素与三唑类、壬菌铜或吡唑醚菌酯混用，防治效果可提高40%～75%。王瑞等[19]研究认为，乙蒜素与溴硝醇1∶5 比例、乙蒜素与代森锰锌1∶3 比例混配，具有较强的增效作用。张毅等[20]证实，病斑刮除后，运用四霉素和噻霉酮混配液进行伤口涂抹具有较好的防治效果。杨贵琴等[21]研究发现，四霉素与噻霉酮5∶1 比例及四霉素与戊唑醇2∶1 比例混配时，对溃疡病抑菌效果明显。郭成[22]及强遥[23]认为，四霉素与大部分药剂混用对溃疡病菌均有增效或加和作用，田间防治效果理想，包括四霉素和乙蒜素1∶1、2∶1 和1∶2 配比。涂美艳等[24]通过田间试验证实，在采果前20 d、采果后7～10 d 以及萌芽期，喷施2%春雷霉素300倍＋43%戊唑醇、0.15%四霉素1 200倍＋80%代森锰锌800 倍等混配药剂，可显著降低红阳猕猴桃溃疡病的病情指数。

与上述前期研究结果基本一致，本文对13 种药剂中室内抑菌效果排名前7 位的药剂进行了1∶1二元混配，制成21 种药剂组合，初步确定了部分药剂混配可提高对溃疡病的抑菌率。如：将乙蒜素与代森铵、铜大师、四霉素、春雷霉素、可杀得3000进行混配后抑菌率均有所提高；四霉素与可杀得3000、乙蒜素及春雷霉素进行二元混配后，抑菌率从85.64%提高至92.49%以上；春雷霉素与乙蒜素、四霉素分别进行二元混配后抑菌率得到了显著提高，从69.34%分别增至93.41%、92.49%。由此进一步证实，针对猕猴桃溃疡病，开发混配防治药剂这一方向是可行的，适当的农药混配组合可显著提高对溃疡病菌的抑菌率及防效，符合国家提出的农药减施增效政策。

此外，本试验进一步发现，4 种不同体积比例的乙蒜素、春雷霉素及四霉素混配均具有显著的增效作用，其中1∶1∶2 的混配组合对溃疡病菌的室内抑菌率达到99.14%，且共毒系数达到247.567 0，较前期复配研究[17-24]及本研究中二元复配组合的抑菌效率明显提高。另外，乙蒜素、春雷霉素及四霉素均为植物或微生物的提取或代谢产物，相较于其他药剂混配而言，更不易产生抗药性，具有安全、绿色及环保的特点，应用前景广阔。2021 年，通过在6 个省30 个地区进行小范围田间防治试验，本研究团队已初步确定了该混配药剂的高效性、安全性及稳定性，并证实了在冬季清园后及早春萌芽前进行刷干涂抹的防治效果明显，优于稀释后喷雾。下一步将在陕西、四川、贵州及河南等猕猴桃主产区进行更大范围的田间试验，通过一系列正交试验进一步确定该混配药剂的年使用次数、用量、最佳喷施时期及施用方式，以期使该混配药剂达到最佳防效，为猕猴桃溃疡病的减施增效、高效防治提供理论依据。