基于生物信息学分析PRKCD 在肝细胞癌组织中的表达及临床意义

胡连涛，邓文俊，孙 跞，鹿士振，李学斌，黎楚豪，王绎博，王欣然，李 玥，王伟群

（1. 佳木斯大学基础医学院，黑龙江 佳木斯 154007；2. 黑龙江省微生物-免疫调解网络与相关疾病重点实验室，黑龙江 佳木斯1540073；3.佳木斯大学第一临床医学院，黑龙江 佳木斯 154007）

肝 细 胞 癌（liver hepatocellular carcinoma，LIHC）是一种常见的消化系统恶性肿瘤，占所有肝癌病例的90%以上，其发病率和死亡率分别居于世界第六和第四位［1］。尽管随着外科技术手段的不断提升，有关LIHC 的临床和实验性治疗已经取得了长足进步，但由于术后肿瘤复发和转移率较高，患者的整体预后仍然较差［2，3］。同时值得关注的是，多种生物分子均可在LIHC 的发生和发展中起着关键作用［4］。因此，寻找可靠的LIHC 生物诊断标志物和制定新的治疗策略仍是LIHC 患者有效治疗的必要前提。

蛋白激酶C（PKC）是由丝/苏氨酸蛋白激酶组成的多基因家族，主要包括PKCα、PKCβ、PKCγ、PKCλ 和PKCδ 等，PKC 通过触发其下游不同信号级联反应，可调节细胞的多种功能，如增殖、分化和凋亡等［5］。蛋白激酶Cδ（PRKCD，PKCδ）是蛋白激酶C 家族的新型同工酶之一，与其他PKC 相同，PRKCD 也由羧基末端激酶结构域、氨基末端调节结构域和铰链区构成。但PRKCD 调节结构域中只含有二酰基甘油（DAG）或其他磷脂信使激活位点，因而对Ca2+不敏感［6］。PRKCD 广泛存在于机体的各组织和器官中，并在炎症和肿瘤等多种疾病中发挥关键作用。有研究表明，PRKCD 的功能基因组改变很少见，而且与癌症没有直接联系，这支持了PRKCD 是癌症“乘客基因”而不是癌症“驱动基因”的观点。由此可见，PRKCD 的激活、表达、定位和/或致癌环境可能在很大程度上决定这种激酶在癌症中的功能［7］。本研究通过生物信息学方法分析PRKCD 在LIHC 中的表达及临床意义，以期为LIHC 诊疗的预后分子标志物和靶点的确立提供新思路。

1 材料与方法

1.1 临床数据的挖掘

利用Rstudio 软件从The Cancer Genome Atlas（TCGA）数据库（https：//portal.gdc.cancer.gov/ repository）中下载正常肝组织和LIHC 组织的mRNA-seq 原始数据，而初步的临床数据则来源于UCSC Xena 平台。然后对这二个原始数据进行排序和汇总，并过滤没有TNM 分期的数据和其他不完全匹配的数据，最终获得419 例样本数据，包括369 例LIHC 和50 例癌旁组织样本。原始计数数据的规范化和癌旁与LIHC 组织之间表达基因的鉴定，均由R 包“edgeR”完成。

1.2 PRKCD 基因在LIHC 和癌旁组织表达差异的研究

使用R 软件读取整理好的TCGA-LIHC 数据库中的基因表达数据，应用“limma”包和“beeswarm”包统计分析PRKCDmRNA 在LIHC 和癌旁组织的差异表达情况，并绘制PRKCD 表达散点差异图；从Human Protein Atlas（HPA）数据库中检索PRKCD 的免疫组织化学染色数据（包括染色强度和数量），以明确LIHC 和正常组织中PRKCD蛋白表达差异。

1.3 PRKCD表达与LIHC临床病理状态关系的研究

应用R 软件读取TCGA-LIHC 数据库的基因表达数据，然后用接收者操作特性曲线来计算曲线下方区域（AUC）面积，以此判断PRKCD 在LIHC中的诊断值；应用PearsonChi-square 检验LIHC 中的PRKCD 表达与其病理学参数之间的相关性。

1.4 PRKCD 表达与LIHC 预后关系的研究

使用Rstudio 软件分别读取TCGA-LIHC 基因表达数据及临床资料数据，应用“survival”程序包将样本中PRKCDmRNA 表达量的中位数作为分界点，以此点将患者分为高、低表达组，分析两组的生存情况。与此同时，应用“survival”及“survminer”程序包将PRKCD 表达量、患者年龄、性别、家族癌症史、TNM 分期、组织学等级、Ishak 得分、Child-Pugh 分级、血管入侵等与总生存期进行相关的单因素和多因素Cox 回归分析。

1.5 PRKCD 表达与LIHC 生物过程和相关信号通路关系的研究

为了分析LIHC 中与PRKCD 表达相关的癌症通路，使用TCGA-LIHC 数据集进行GSEA 分析。参考基因集是c2.cp.kegg.v7.1.symbols.gmt，用其计算规范化富集分数。当P值和假发现率q 值均小于0.05 时，则认为基因集显著丰富。

1.6 PRKCD 表达与LIHC 遗传和表观遗传学关系的研究

为了分析PRKCD基因表达变化的原因，从遗传和表观遗传学的角度利用R 软件检测PRKCD DNA 甲基化和拷贝数突变与其表达量之间的关系。原始数据来源于整理后的TCGA-LIHC 数据集，因在CNA 数据中有关拷贝数深度丢失和深度扩增的数据过少，故只考虑了拷贝数的轻度丢失和轻度的拷贝数扩增与正常二倍体样本的差异。

1.7 统计学分析

采用R 软件以及SPSS Statistics19.0 软件进行分析。应用Mann-WhitneyU检验分析LIHC 和癌旁组织中PRKCD 的表达差异；应用PearsonChisquare 分析PRKCD 表达与临床病理参数之间的相关性；应用Kaplan-Meierr 分析PRKCD 表达与LIHC 患者生存能力的关系；应用单因素和多因素Cox回归模型分析PRKCD 在LIHC 患者中的预后意义。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 PRKCD 在LIHC 组织中表达上调

对TCGA-IHC 数据中非配对的LIHC 及癌旁样本分析结果表明，PRKCDmRNA 在LIHC 组织中的表达水平较癌旁组织显著上调（P＜0.01，图1A）。进一步利用HPA 数据库分析显示，大多数LIHC 样本中PRKCD 蛋白质水平亦高于癌旁组织（图1B）。

图1 PRKCD 在LIHC 组织中表达上调Fig 1 PRKCD expresses an upward adjustment in the LIHC tissues

2.2 PRKCD 表达与LIHC 患者临床病理特征具有相关性

利用TCGA-LIHC 数据将PRKCD 表达与LIHC 患者临床病理参数进行相关性分析发现，PRKCD基因表达水平与患者TNM 分期（图2A）、组织学等级（图2B）、AFP 含量（图2C）和生存状态（图2D）相关。且随着TNM 分期的增高、组织学分化程度的降低、甲胎蛋白水平的升高，PRKCD基因表达水平有上升的趋势。此外，通过ROC 曲线计算得出AUC=0.744（P＜0.000 1），说明PRKCD表达水平对临床诊断具有一定的诊断准确性（图2E）。

图2 PRKCD 基因表达与LIHC 患者临床病理特征相关性分析Fig 2 Analysis of the correlation between PRKCD gene expression and clinical pathological characteristics in LIHC patients

2.3 PRKCD 表达上调与LIHC 患者预后不良具有相关性

应用Kaplan-Meier 对TCGA-LIHC 数据中PRKCD基因高、低表达组总体生存率进行差异分析发现，低表达PRKCD 患者的总体生存率显著高于高表达组（P＜0.01），说明PRKCD 表达水平与LIHC 患者预后相关（图3A）。对TCGA-LIHC 数据进行单因素及多因素Cox 回归分析显示，PRKCD可作为LIHC 患者的独立预后因素（表1）。此外，因Cox 回归分析表明TNM 分期可影响患者的生存能力，故进一步应用Kaplan-Meier 在TNM Ⅰ～Ⅳ期中分析PRKCD 表达与总体生存率的关系，结果发现Ⅲ、Ⅳ期生存曲线的风险比（HR）明显大于Ⅰ、Ⅱ期，说明随着TNM 分期的增高，PRKCD表达对患者的危险作用也随之增大（图3B、3C）。

图3 LIHC 患者生存曲线Fig 3 LIHC patient survival curve

表1 影响肝细胞癌患者预后的危险因素分析Tabl 1 Analysis of risk factors affecting prognosis in patients with hepatocellular carcinoma

2.4 PRKCD 富集在肿瘤进程和相关信号通路

为了明确PRKCD 在LIHC 中的功能，我们在基因本体中进行GSEA 分析。结果显示，PRKCD主要富集在细胞周期和DNA 复制等过程，并与两者呈正相关性（图4A、B）。此外，进一步对相关信号通路分析显示，PRKCD 主要可参与趋化因子（图4C）、NOD 样受体（图4D）、PPAR（图4E）、脂肪细胞因子（图4F）和T 细胞受体等肿瘤相关信号通路（图4G）。

图4 GSEA 分析图Fig 4 GSEA analysis

2.5 PRKCD CNA 和甲基化水平影响其表达

了解PRKCD 表达变化的原因，本研究从遗传和表观遗传学的观点利用R 软件检测TCGA-LIHC中PRKCD的表达与拷贝数变异以及甲基化的关系。结果显示，PRKCD基因拷贝数的增加会使其表达水平上升（P＜0.05，图5A），而随着PRKCD 甲基化水平的上升，其的表达量则逐渐降低（图5B）。

图5 PRKCD 表达水平与CNA 和甲基化相关性分析Fig 5 Analysis of the correlation between the expression level of PRKCD and CNA and methylation

3 讨论

既往研究表明，PRKCD 可以抑制结肠癌细胞的增殖［8］。然而，另一些研究则表明，PRKCD可以作为乳腺癌和肺腺癌的癌基因而促进肿瘤的发展［9，10］。这说明在肿瘤的发生和发展中，PRKCD 的调控作用是极其复杂且矛盾的，其在不同的肿瘤中可能分别具有抑癌或促癌的作用。在抑癌方面，Gonzalez-Guerrico 等［11］在前列腺癌研究中发现，佛波酯可诱导肿瘤细胞凋亡，该过程是通过PRKCD参与死亡受体配体的分泌及死亡受体下游凋亡信号转导来实现的。同样，Liu 等［12］的研究发现，PRKCD 可经调控死亡受体表达，来影响内质网应激介导的细胞凋亡。以上研究说明，PRKCD 的活化对于肿瘤坏死因子相关凋亡配体和肿瘤坏死因子-α 等死亡受体诱导的细胞凋亡极为重要。另外，还有研究表明PRKCD 的耗竭在细胞死亡导致的退行性疾病和组织损伤中具有保护作用，通过用各种毒素诱导细胞凋亡并同时上调PRKCD，PRKCD 可能是凋亡的全局调控子［13-15］。在促癌方面，Yuan等［16］研究发现，PRKCD 抑制剂可以调节肿瘤干细胞的活性，并抑制胃癌细胞的转移。同样，Berardi［17］和Chen 等［18］研 究 报 道，PRKCD 在 多 种 肿 瘤 中均可促进肿瘤干细胞的存活。例如，在一项有关肿瘤恶性表型的研究中发现，当下调PRKCD 表达后，干细胞的自我更新潜能和致癌潜能也随之被抑制，反之，PRKCD 的激活则可对肿瘤干细胞的上述潜能具有促进作用，进一步机制研究证实，一个持续存在的、由PRKCD/STAT 3/IL-23/JAK 信号轴驱动的自分泌反馈机制在PRKCD 的激活中发挥重要的调节作用［19］。同样，类似的研究表明，PRKCD 耗竭可以抑制小鼠模型中的乳腺癌、胰腺癌和肺癌肿瘤的形成［20-22］。

尽管人们已经开展了大量有关PRKCD 与多种肿瘤相关性的研究，但其在LIHC 发生、发展中的作用却鲜有报道。本研究首先从TCGA-LIHC 和HPA 数据集中挖掘出的资料进行研究，发现在LIHC 中PRKCD 无论在mRNA 还是在蛋白表达水平上均显著高于癌旁组织或正常肝组织。随后，我们又证实PRKCD 表达与多种LIHC 临床病理特征具有显著相关性，表现为PRKCD 水平上调与高TNM分期、高AFP 含量、低分化程度相关，且ROC 曲线也表明PRKCD 在临床诊断中具有一定的准确性。另外，生存曲线和COX 生存分析表明，低表达PRKCD 的患者生存能力显著提升，且随着TNM 分期的增高，PRKCD 表达对LIHC 患者生存的危险作用也随之增大，故PRKCD 可作为LIHC 患者的独立预后因素。同时GSEA 分析发现，PRKCD 可能通过趋化因子、NOD 样受体、PPAR、脂肪细胞因子和T 细胞受体信号通路参与细胞周期和DNA 复制等过程，进而促进LIHC 细胞的增殖。最后的遗传和表观遗传学分析发现PRKCD基因的拷贝数增加会使其表达水平上升，而PRKCD甲基化水平与其表达水平呈负相关。

综上所述，本研究主要通过生物信息学方法分析了PRKCD 在LIHC 中的表达及临床意义，发现PRKCD基因可能会成为LIHC 临床预后评估的新指标和分子靶向治疗的新靶点，本研究初步探讨了PRKCD 在LIHC 中的可能参与的信号通路和表达变化的原因。但由于本研究基于大数据分析，具有一定的局限性。因此，后续研究需要从临床实际样本和基础实验方面进一步验证和阐述PRKCD 在LIHC 中的表达、作用及其相关分子机制。