6个香雪兰品种的染色体核型及聚类分析

过雪莹 朱凯琳 陈 昕 付雪晴 唐东芹*

（1. 上海交通大学设计学院，上海 200240；2. 南京林业大学生物与环境学院，南京 210037）

香雪兰（）又名小苍兰、香鸢尾、洋晚香玉等，属鸢尾科（Iridaceae）香雪兰属（）多年生球根花卉，花姿典雅、花色丰富、香气怡人，深受人们喜爱，是一种重要的切花及盆栽观赏植物。目前，现代应用的香雪兰绝大数为杂交品种，通常以指代该属内园艺杂交品种，由于育种时间长，遗传背景复杂，在新品种引进和选育工作上具有一定盲目性，因此，开展香雪兰品种间的亲缘关系及进化程度研究具有重要意义。核型是生物遗传物质在细胞水平上的表征，与外部形态相比，受外界环境因素影响较小，更能保持相对稳定；同时，基于核型参数的聚类分析可以与已有的系统解剖学和分子标记结果所建立的分类进行相互印证。因此，核型分析已成为基于细胞学研究遗传多样性的重要方法，研究表明它可以为观赏植物品种间亲缘关系的鉴定提供一定的参考价值，并为品种选育和杂交育种等提供理论依据。

目前利用核型分析方法来鉴定染色体组学信息在许多观赏花卉中已有运用，如在金盏菊（）、迷迭香（）、芍药（）、风信子（）、春 兰（）和惠兰（）等物种上已有相关核型研究。而关于香雪兰属内种的核型研究早期也有一些报道。最早的文献见于1926 年的的染色体组数。在1971 年，Goldblatt 等学者对属内11 个野生种中的4 种、、和cf.进行了染色体数目的鉴定。这时期内，Lawrence 又报道出关于几种的染色体组数。随后，在1988 年，王丽等才首次报道了的具体核型情况，发现这个种有6 对亚中着丝粒染色体、4 对中着丝粒染色体和1 对端着丝粒染色体（参考附表1）。

附表1 早期香雪球属植物的染色体及核型资料Supplementary table 1 Chromosome and karyotype data of early taxa of the genus Freesia

由于观赏植物种间杂交频繁、品种更新很快，经常导致不同栽培品种间的亲缘关系难以鉴定，故运用包括核型分析在内的多种方法来分析品种之间的核型差异及亲缘关系的方法已较为常见，发现核型差异与植物品种间亲缘关系确实存在一定关联。如对秋英属中波斯菊（）的7 个品种和硫华菊（）的2 个品种进行了核型比较及亲缘关系的分析鉴定，还有学者对6 个金银花（）栽培品种进行了核型分析比较。通过对17个品种绣线菊（）的染色体特征进行相关性和聚类分析，刘慧民等探讨了其品种进化及亲缘关系。而关于香雪兰品种间亲缘关系的报道前期主要集中在表观形态、生理生化和分子3个层面。如从叶、花、花粉、球茎等部位的形态特征探讨了部分香 雪兰品 种间的 亲缘关 系。Wongchao‑chant 等和陈诗林等则利用花芽分化、休眠相关的生理指标及球茎中的可溶性蛋白质对香雪兰品种之间的亲缘关系进行了探讨。此外，还有文献利用ISSR、EST-SSR和RAPD等分子标记技术研究了香雪兰品种间的亲缘关系。但是，迄今为止，利用染色体核型分析方法来研究香雪兰不同品种间的核型差异及亲缘关系的研究鲜见报道。

本研究以香雪兰的6 个栽培品种为试验材料，通过染色体核型分析方法，明确各品种间的核型特征，进而利用其核型参数进行聚类分析，以探索品种间的核型差异及进化程度，旨在为今后香雪兰品种的鉴定、起源、演化、良种培育及进一步的分子生物学研究等提供必要的细胞遗传学资料，为丰富香雪兰遗传多样性等提供细胞学基础。

1 材料与方法

1.1试验材料

以6 个香雪兰栽培品种为研究对象（见表1，图1）。其中，‘上农红台阁’（下文图表中由‘SN Hongtaige’表示）为上海交通大学自主培育品种，其余5 个品种均为国外进口品种，购自荷兰Van den bos 公 司（https：//www.Vandenbos. com），于2018—2020年取样测定。

图1 供试香雪兰6个品种A‘.Gold River’；B‘.White River’；C‘.Castor’；D‘.上农红台阁’；E‘.Pink Passion’；F‘.Red River’；下同Fig.1 Materials of 6 cultivarsA‘.Gold River’；B‘.White River’；C‘.Castor’；D‘.SN Hongtaige’；E‘.Pink Passion’；F‘.Red River’；The same as below

表1 香雪兰6个栽培品种的基本信息Table 1 Basic information of 6 cultivars of F.hybrida

1.2试验方法

选择生长健壮的香雪兰植株进行水培，于08：00—10：00 用镊子和解剖针取下根尖做材料，将其用蒸馏水冲洗干净，置于0.05%秋水仙素和0.002 mol·L8-羟基喹啉1∶1 混合液中，在4 ℃环境下避光处理1～2 h。再转入到卡诺固定液（（无水乙醇）∶（乙酸）=3∶1）中，于室温下固定12 h。再将固定好的根尖材料用蒸馏水洗净，放入1 mol·L的HCl（60 ℃水浴）解离8～10 min。待解离后的根尖材料充分冲洗后，取约1 mm 的根尖分生组织，放入卡宝品红溶液中染色6 min。利用常规方法压片，镜检，观察到分散良好的中期染色体后，显微拍照采集图像。

1.3倍性鉴定与核型分析方法

参考李懋学等提出的标准，选取30 个以上染色体分散较好的中期细胞统计染色体数目。其中选取5个分散良好，染色体纵向收缩程度均匀一致，缢痕区显示清晰的染色体中期照片进行核型分析。参考Levan 等和Kuo 等方法分别计算相对长度、相对长度系数等相关核型参数；参考Arano的方法计算核型不对称系数；参照Steb‑bins的标准进行核型分类；对核型的主要参数进行综合分析，得出核型公式。

计算公式如下：

1.4数据分析及统计方法

使用Auto CAD 2015 软件测量染色体长度，运用Excel 2010 和Adobe Photoshop CS4 软件处理数据，进行同源染色体配对并制作核型模式图。利用SPSS 11 软件，选用平均臂比为横坐标，染色体长度比为纵坐标，建立核型不对称散点图；同时对香雪兰品种的各染色体核型参数进行标准化转化，采用平方欧氏距离，利用组间连接法进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1香雪兰核型参数分析

分别观测香雪兰6个品种的中期分裂细胞，发现它们由11对染色体构成，属于四倍体植物，其染色体分裂相和核型模式图结果如图2～3 所示。并对各品种的核型参数进行统计（见表2～3）。

表2 香雪兰6个品种的染色体组型Table 2 The karyotype analysis of six cultivars of F.hybrida

图2 香雪兰6个品种的中期分裂相Fig.2 Photomicrographs of chromosome at metaphase in six cultivars of F.hybrida

结果表明，‘Gold River’染色体核型公式为2n=4x=44=33m+11sm，无随体出现。染色体的相对长度系数组成为2n=6L+18M1+15M2+5S，相对长度为6.15%～12.98%。臂比值为1.07～1.94，平均臂比值为1.47。其染色体的长度比为2.62；臂比值大于2 的染色体占总染色体的6.82%。核不对称系数为59.07%，核型为2B型（见图2A）。

‘White River’染色体核型公式为2n=4x=44=1M+34m+9sm，具有1 个中部着丝点类型。染色体的相对长度系数组成2n=6L+15M1+14M2+9S，相对长度为6.13%～12.09%。臂比值为1.12～1.84，平均臂比值为1.46。其染色体的长度比为2.21；臂比值大于2 的染色体占总染色体的2.27%，核不对称系数为59.30%，核型为2B型（见图2B）。

‘Castor’染色体核型公式为2n=4x=44=35m+9sm，染色体的相对长度系数组成为2n=4L+23M1+14M2+3S，相对长度为6.24%～13.42%。臂比值为1.15～2.25，平均臂比值为1.52。染色体的长度比为2.60；臂比值大于2 的染色体占总染色体的6.82%，核不对称系数为60.05%，核型为2B 型见图2C）。

‘上农红台阁’染色体核型公式为2n=4x=44=32m+12sm，染色体的相对长度系数组成为2n=8L+19M1+12M2+5S，相对长度为6.45%～13.16%。臂比值为1.11～2.03，平均臂比值为1.52。该品种染色体的长度比为2.54；臂比值大于2的染色体占总染色体的9.09%。核不对称系数为60.07%，核型为2B型（见图2D）。

‘Pink Passion’染色体核型公式为为2n=4x=44=38m+6sm，染色体的相对长度系数组成为2n=5L+23M1+13M2+3S，相对长度为6.81%～13.64%。臂比值为1.09～1.58，平均臂比值为1.35。其染色体的长度比为2.71；臂比值大于2的染色体占总染色体的2.27%。核不对称系数为57.00%，核型为2B型（见图2E）。

‘Red River’染色体核型公式为：2n=4x=44=37m+7sm，无随体出现。染色体的相对长度系数组成为2n=6L+16M1+16M2+6S ，相对长度为6.65%～12.81%。臂比值为1.10～1.79，平均臂比值为1.42。该品种染色体的长度比为2.84；臂比值大于2 的染色体占总染色体的4.55%。核不对称系数为58.22%，核型为2B型（见图2F）。

图3 香雪兰6个品种的核型模式图Fig.3 Photomicrographs of karyotype pattern in 6 cultivars of F.hybrida

可见，6 个香雪兰品种均为四倍体，染色体数目都为44。只有‘White River’中具有M、m、sm 3种着丝点类型，而其他品种均只有m、sm 2 种着丝点类型，且6 个品种中均未观测到随体出现，核型类型均为“2B”型。其中，‘Castor’在相对长度范围和臂比范围上均为最广，‘上农红台阁’核不对称系数最大。

2.2香雪兰品种核型参数散点图分析

核型不对称散点图中，坐标点接近右上方表示核型不对称性强，进化程度高。反之，坐标点越靠近左下角代表其不对称性越低，种的进化程度相对也越低。从图4 整体结果来看，6 个香雪兰品种的不对称性程度均较大。‘Castor’、‘上农红台阁’均最靠近图右方，故两者相对其他品种而言，不对称性最大且进化程度相当。‘Red River’和‘Pink Passion’最靠近图左方，故相对而言，两者进化程度较低，但‘Red River’相比‘Pink Passion’而言，进化程度较大。在这6个品种中，‘Red River’和‘Pink Passion’在染色体长度比方面进化较快，而‘White River’在平均臂比方面进化较快，‘Gold Riv‑er’在两方面进化方向相对均衡。结合表3中的核不对称系数，可得：6种香雪兰植物的进化程度由低到高为：‘Pink Passion’→‘Red River’→‘Gold River’→‘White River’→‘Castor’→‘上农红台阁’。

表3 香雪兰6个品种的核型公式及核型参数Table 3 Karyotype formulas and parameters of 6 cultivars of F.hybrida

图4 6个香雪兰品种的核型不对称性散布图Fig.4 Scatter diagram of 6 cultivars of F. hybrida based on the degree of karyotypic asymmetry

2.3香雪兰植物品种核型参数聚类分析

Inceer 等提出以核型数据为基础的聚类分析能更好地考察物种间的亲缘关系。基于上述核型参数，本研究进行聚类分析（见图5），结果发现，香雪兰品种间的遗传距离变化范围大，为1.2～25.0，具有较为丰富的遗传多样性。其中，‘Pink Passion’和‘Red River’、‘Gold River’和‘上农红台阁’两两之间的遗传距离最小，都为1.2，说明‘Pink Passion’和‘Red River’、‘Castor’和‘上农红台阁’之间核型相似程度较高，亲缘关系最近。在遗传距离为15.0 时，可将6 个品种明显分为2 类，第一类包括‘Gold River’、‘上农红台阁’和‘Cas‑tor’，这3 个品种的染色体长度比较为接近，其核型不对称系数、臂比均值均较大且近似；第二类包括‘Pink Passion’、‘Red River’和‘White River’，这3个品种的核不对称系数均较小且近似，各染色体着丝点类型的数量差别不大，相对长度范围及臂比范围也均相对较小。

图5 6个香雪兰品种的核型聚类图Fig.5 Karyotype clustering figure of 6 cultivars of F.hybrida

3 讨论

核型是了解植物系统发育和进化的一个重要参数，可以为植物分类与鉴定提供可靠的细胞学依据。据Goldblatt 报道，1945 年Lawrence 发现香雪兰属内染色体数目为2n=2x=22、2n=3x=33、2n=4x=44。香雪兰染色体基数均为11 这一结果获得了后面研究者的证实。本研究发现，香雪兰6 个品种染色体数目均为2n=4x=44，基数为11，故均为四倍体，与上述研究结果相一致。

研究表明，染色体能很好地反映物种在遗传上的差异和亲缘关系。核型分析结果显示，香雪兰6 个品种都是中部着丝粒染色体数量多于亚中部着丝粒染色体数量，且均无随体，说明品种之间具有一定相似性，在亲缘关系上存在一致性。且‘Pink Passion’和‘Red River’之间、‘Gold River’和‘上农红台阁’之间的核型只存在一条染色体区别，相似程度高，初步证明了其两两之间的亲缘性最近，推测其品种形成过程中可能有相同的亲本参与。但不同品种间的核型也出现了一些差异，如‘White River’核型中出现一条正中部着丝粒染色体，而这是其他5 个品种所不具备的，体现出了一定的进化现象，可能与它的亲本及人为选育目标有关。

核型不对称性可较为科学地反映核型或植物的进化程度。Stebbins 研究中提出，高等植物核型进化基本是由对称向不对称方向发展。核型相似程度越高，物种间亲缘关系越近，因此核型不对性指标是衡量植物进化及亲缘关系的重要参数之一。所观察的6 个香雪兰品种的染色体核型不对称系数范围较大，表明香雪兰存在较为复杂的遗传关系，这与其长期自然选择和人工培养驯化的进程有关，不同育种目标、不同环境需求导致不同的育种亲本渗入，形成了适应当地环境的品种群体，致使地方品种进化程度参差不齐。其中，‘上农红台阁’核不对称系数最大，‘Castor’也较大，与‘上农红台阁’极为接近，意味着这2 个品种可能存在共同的亲本。根据核型不对称系数，推测这6 个香雪兰品种核型进化的基本趋势为：‘Pink Passion’→‘Red River’→‘Gold River’→‘White River’→‘Castor’→‘上农红台阁’，该结果可被核型散点图反映的结果所佐证。此外，根据Stebbins的分类，6 个香雪兰品种均为2B 型，说明它们都处于由对称向不对称过渡的阶段，进化程度中等且亲缘关系较近，核型类型结果与核型不对称系数所反映的结果相一致，可互相映证结果的可靠性。

核型进化遗传距离是利用物种的核型数据对物种间的相似性进行多向、立体、多维的考察，从而判断物种间的亲缘关系，故是传统分类学中一种非常好的补充方法，这在许多观赏植物中已有相关研究报道。从上述结果来看，在遗传距离为15 时，可将6 个香雪兰品种分为2 类，其中‘Gold River’与‘上农红台阁’、‘Pink Passion’和‘Red River’分别在很短的距离上先聚在一起，说明两两之间进化程度相当，亲缘关系最近；在遗传距离为4 和11 时，‘Castor’和‘White River’分别与上述2个组合聚在一起，说明这2个品种与前面品种存在一定的遗传差距，亲缘关系远近差异较大，尤其是‘White River’相较于其他品种亲缘关系最远，这可能与其独特的核型变化有着较大关系。上述结果与前期基于ISSR分子标记分析香雪兰品种亲缘关系的结果相似：发现‘Pink Passion’和‘Red Riv‑er’聚为一类，‘Castor’则与该两者亲缘关系较远。基于花粉特征的聚类也同样显示，‘Pink Passion’和‘Red River’亲缘很近，而与‘White Riv‑er’较远。但是，聚类结果与上述根据核型不对称系数推测的进化程度并不完全吻合，这在其他植物中也有类似结果报道。可见，单一凭借核型特征不足以完全反映其亲缘关系，需要结合其他多方面的研究结果综合进行。

因为长期的杂交育种导致现代香雪兰栽培品种的遗传背景相当复杂，引起其核型差异变化的具体原因有待更多的研究验证。本文分析了6 个香雪兰品种的核型特征并籍此探讨了亲缘关系，可以为今后丰富香雪兰品种遗传多样性、种质资源鉴定等提供理论参考。