大鼠全眼球石蜡组织切片制作方法的改进*

严伟明 叶 倩 龙 盘 陈小红 陈艳津王雨彤 危冬昱 张作明 陈梅珠 陈 涛

(1.中国人民解放军联勤保障部队第九○○医院 福建医科大学福总临床医学院 厦门大学附属东方医院，福州 350025)(2.中国人民解放军空军军医大学航空航天临床医学中心，西安 710032)(3.中国人民解放军西部战区总医院，成都 610083)

大鼠眼球石蜡组织切片被广泛应用于眼科基础实验中[1-2]。然而，由于眼球结构较复杂，各部分组织密度相差较大，按常规方法制作眼球石蜡组织切片，易出现眼球结构变形、紊乱、视网膜脱离等不理想效果[3-4]。探索一种制作大鼠全眼球石蜡组织切片的改进方法对眼科基础实验研究具有一定的意义。本研究结合前期相关文献研究方法，对大鼠全眼球石蜡组织切片制作方法进行新的探索，以期寻求一种较为简单、方便、有效的方法。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级健康成年雄性Sprague Dawley(SD)大鼠(购于空军军医大学实验动物中心，生产许可 证号：SCXK(陕)2019-001)，6～8周龄，体质量180～220 g。实验动物按照联勤保障部队第九〇〇医院实验动物福利伦理委员会的相关规定进行实验，伦理审查编号：P20190715-3。

1.2 主要实验试剂与器材

戊巴比妥钠溶液(1%体积质量比，上海行知化工厂，批号#921019)；速眠新(吉林省华牧动物保健品有限公司，批号#(2004)005013)；A固定液：4%多聚甲醛(上海远慕试剂公司，批号#YM-MY803J)；B固定液：10%中性福尔马林(浙江同和生物公司，批号#20170017)；C固定液(混合固定液)：冰醋酸(天津富宇试剂，批号#200-580-7)、甲醛(广东西陇科学公司，批号#1804242)、生理盐水、75%乙醇(合肥辰宇化工有限责任公司，批号#67-17-5)，按1∶2∶7∶10比例配制。

组织包埋机(常州市雅博电子设备有限公司，型号#YABO400)；自动脱水机(常州市雅博电子设备有限公司，型号#YABO600)；旋转石蜡切片机(上海赛默飞世尔仪器有限公司，型号#Finesse 325)；自动恒温摊片烤片机(西安瑞丰仪器设备有限公司，型号# GTK-2002)。

1.3 方法

1.3.1动物分组：取上述18只SD大鼠，按随机数字表法随机分为3组，即A固定液组、B固定液组和C固定液组，每组6只。

1.3.2眼球固定：用戊巴比妥钠溶液腹腔注射过量剂量麻醉处死各组大鼠后，立即取其左、右眼球(取眼球时尽量保留较长的视神经以便后期进行组织切片时定位经视神经的切片)，处理眼球周围多余组织后，将眼球分别固定于3种相应固定液中；固定2 h后，在各组大鼠左眼中央角膜处用1 mL注射器扎一小孔，右眼用锐利刀片沿瞳孔-视神经轴方向在眼球颞侧巩膜剖一小开口(长约0.5 cm，不需全部切开侧面)，之后再将左、右眼球放回各自固定液中继续固定24 h。

1.3.3组织脱水、透明、浸蜡：将固定24 h后的各组大鼠眼球置于自动脱水机中，经以下步骤处理：(1)梯度脱水：70%乙醇(3 h)-85%乙醇(1 h)-95%乙醇(1 h×3)-100%乙醇(1 h×3)；(2)透明：二甲苯(15 min × 2)；(3)浸蜡：石蜡(56～58 ℃，2 h×2)。

1.3.4蜡块包埋与切片制作：在组织包埋机上，按瞳孔-视神经轴方向，横向固定眼球进行包埋，待凝聚成蜡块后，在旋转石蜡切片机上，每个眼球沿瞳孔-视神经轴取经视神经连续3张切片，厚度为4 μm，摊片、捞片后，在烤片机上70 ℃烤片20 min。

1.3.5苏木精-伊红(HE)染色：各切片按以下流程操作：(1)脱蜡至水：二甲苯(10 min × 3)-100%乙醇(1 min)-95%乙醇(1 min)-80%乙醇(1 min)-自来水(5 min)；(2)HE染色：苏木精液(5 min)-自来水(1 min)-0.5%盐酸乙醇液(5 s)1% 氨水 (10 s)-自来水(5 min)-伊红(2 min)-自来水(1 min)-95%乙醇(1 min×2)-100%乙醇(1 min)-100%乙醇(2 min)-二甲苯 (2 min × 2)；(3)中性树脂封片。

1.3.6观察：在光学显微镜下对眼球石蜡组织切片效果进行观察并拍照。重点观察整个眼球形状与结构、虹膜睫状体结构、晶状体完整性、有无视网膜脱离、视网膜各层结构完整性等。

2 结果

采用A固定液(4%多聚甲醛)和B固定液(10%中性福尔马林)固定的眼球，经过角膜扎孔(左眼)或者眼球巩膜侧壁剖开(右眼)，整体眼球结构都有较明显的皱缩变形；晶状体固定较差，结构存留少(图1A，B)；虹膜睫状体略有皱缩(图2A，B)；视网膜脱离，甚至发生视网膜断裂，各细胞层细胞核连续性较差，甚至发生断裂(图3A，B)。相对于左眼，右眼眼球总体结构保存较好(图1-2-A，B)；存在一定程度视网膜脱离，视网膜结构相对完整，未见明显视网膜劈裂(以B固定液，即10%中性福尔马林效果较显著)(图2-2-B，C)。

图1 各组大鼠全眼球石蜡组织切片苏木精-伊红染色-整体观(×40)注：1：左眼；2：右眼；A、B、C：4%多聚甲醛固定液、10%中性福尔马林固定液、混合固定液；黑色箭头：视网膜脱离；标尺：1 000 μmFig.1 Hematoxylin-eosin staining of whole eyeball paraffin-sections of all rat groups-the holistic view (×40)Note: 1: the left eye; 2: the right eye; A, B, C: the fixative of 4% paraformaldehyde, 10% neutral formalin, and a mixed fixative solution, respectively; Black arrowhead:the sign of retinal detachment; Scale bar: 1 000 μm

采用C固定液固定后的大鼠眼球，左眼(角膜扎孔)或右眼(眼球巩膜侧壁剖开)整体眼球结构完整性较好，无明显形态皱缩(图1C)；虹膜睫状体结构舒展(图2C)；视网膜结构完整，视网膜神经组织与色素上皮层连接紧密，未见明显视网膜脱离发生，各细胞层细胞核连续性较好(图3C)。相对于左眼(图1-1-C)，右眼晶状体固定效果较好，结构较完整(图1-2-C)。

3 讨论

全眼球石蜡组织切片可对眼球组织形态结构进行整体的观察；进一步采用全眼球石蜡组织切片进行免疫组织化学染色，能方便清楚地得知某些分子或蛋白在整个眼内组织的表达定位情况[5-6]。然而由于眼球结构精密，由多个部分组成(眼球壁外、中、内3层，包括眼内容物如晶状体、玻璃体等)，各部分结构密度差异较大，若按常规方法进行全眼球石蜡组织切片制作，难以得到较好的组织形态，容易出现眼球皱缩、眼内结构紊乱、视网膜脱离、视网膜断裂等[7]。不少研究对此技术进行探索和改进，包括改进固定液，改变固定时间、脱水时间，更换质量较好的石蜡以及对眼球进行适当解剖处理等[8-10]。其中，有研究改进了眼球固定液，采用冰醋酸、甲醛、生理盐水、75%乙醇，按比例1∶2∶7∶10配制，固定小鼠眼球，所制作出的小鼠眼球石蜡组织切片效果较好[11]。然而，该研究未报道此固定液对于大鼠眼球组织的固定效果。

大鼠眼球较小鼠眼球体积大，内容物间距更大，组织密度变化更明显。制作大鼠全眼球石蜡组织切片，一般都需提前对大鼠眼球进行适当解剖处理再进行固定，如在眼球巩膜两侧开窗，去除晶状体(由于晶状体密度较高，不容易固定及切片)，或者去除角膜等[4]。经前期预实验结果发现，大鼠眼球未经适当解剖处理，采用上述固定液直接进行固定也难取得较好切片效果(可能原因为固定液较难完全渗透眼球内部组织)。综合上述多种方法，本研究采用在眼球固定2 h后直接在角膜中央扎孔或沿瞳孔-视神经轴方向从眼球颞侧巩膜剖一小开口再固定24 h，以探讨切片制作效果。在固定2 h后，眼球结构有一定硬度；此时再进行眼球解剖处理，可防止解剖操作造成眼球结构变形。本研究采取的剖开眼球巩膜侧壁或角膜扎孔的目的同其他眼球解剖方法一致，即加强固定液浸润眼内组织，且利于后期石蜡的浸润。在本研究中，通过左眼、右眼对比，可以看到即使在使用混合固定液组，左眼(即在角膜中央扎孔的方法)，比其他固定液组的眼内结构完整；这在一定程度体现了混合固定液可较充分渗透组织取得固定效果的优点。具体原理在于混合固定液中的甲醛有固定组织蛋白的作用；冰醋酸对组织具有膨胀作用，且可加强固定液对组织浸透；乙醇可使组织收缩，在一定程度对抗冰醋酸的膨胀作用。这些液体成分的共同作用可使眼球组织得到较充分的固定，同时不会发生明显的结构变形。然而，这种眼部解剖方法配合使用混合固定液，仍存在一定的组织固定欠充分情况。本研究中，右眼眼球是在眼球巩膜侧壁剖开约0.5 cm的窗口，这相对于角膜中央针扎孔的方法更有利于固定液直接进入眼内组织，取得更彻底固定的效果。在本研究中，混合固定液组中右眼眼球晶状体的组织成分明显较左眼完整，而在其他两组的右眼其眼内结构也明显较左眼的完整，以此说明了这种眼球巩膜侧壁剖切的解剖方法可取得相对较好的组织固定结果。

此外，在眼球组织脱水过程中本研究将透明剂二甲苯的时间设为15 min×2，是为了防止由于二甲苯浸泡时间过长导致眼球组织变硬变脆，影响后期眼球石蜡组织切片效果。其他研究中也对透明剂二甲苯使用时长采用相类似的改进方法[4]。

本研究结果表明，制作大鼠全眼球石蜡组织切片采用混合固定液，固定眼球2 h后，行眼球巩膜侧壁纵剖，继续固定24 h后，进行脱水(包括二甲苯透明15 min × 2)、包埋、切片等后续处理，所制作出的大鼠全眼球石蜡组织切片HE染色较清楚，眼球结构较完整，无明显变形，晶状体结构固定效果较好，虹膜睫状体结构舒展，无明显视网膜脱离，视网膜细胞核层连续性较好。该方法解剖操作较简便、快捷，可在一定范围内推广进行大鼠全眼球石蜡组织切片制作。