绿色低共熔溶剂提取黄酮类化合物的研究进展

付佳乐，耿 直

(陕西国际商贸学院医药学院，陕西 西安 712046)

黄酮类化合物是一类具有2-苯基色原酮结构的化合物。因其第一位上的氧原子与强酸结合成盐，衍生物多呈黄色，故又称黄碱素或黄酮。黄酮类化合物具有抗氧化、抗菌、促进机体微循环、降低胆固醇等多种药理活性，可以降低心脑血管疾病的发生率，也可以改善心脑血管疾病的症状。

作为一种新型的环境友好型绿色溶剂，且能增强微波和超声的提取效果，低共熔溶剂在中药有效成分的提取方面有着巨大优势，在替代传统溶剂和毒性溶剂上存在巨大潜力。作者介绍了低共熔溶剂的分类，综述了低共熔溶剂提取黄酮类化合物的研究进展，以期为后续黄酮类化合物的开发应用和低共熔溶剂的使用提供参考。

1 低共熔溶剂的分类

文献[1,4]报道，根据氢键供体与氢键受体种类的不同，将低共熔溶剂分为6类。

1.1 季铵盐-无水金属氯化物

这是早期研究最多的一种低共熔溶剂体系，其金属氯化物部分为AlCl3或Fe、Ag、Cu、Cd、Zn、Sn、La等的氯化物，其使用会受到环境湿度的影响。

1.2 季铵盐-含结晶水金属氯化物

为扩大适用范围，引申出该类低共熔溶剂。该类金属氯化物含有一定的水分，生产成本更为低廉，且不受生产环境湿度的影响，因此，能够广泛应用于工业化大生产。

1.3 季铵盐-酰胺、羧酸、醇等

季铵盐组分常选用氯化胆碱。氯化胆碱无毒，能够进行批量生产，成本非常低廉，且能够生物降解，适用于大规模应用。酰胺、羧酸、醇等组分，通常采用碳酰胺、乙酰胺、乙酸、柠檬酸、苯甲酸、戊二酸、丙三醇、丙二醇、1,4-丁二醇等。该类低共熔溶剂在中药活性成分的提取中较为常用。

1.4 有机配体(尿素、乙酰胺、乙二醇等)-金属卤化物

无机阳离子因其本身结构性质特点不能形成低熔点的共熔物，因此加入有机配体如尿素、乙酰胺、乙二醇等，混合得到过渡金属共熔物，但该类低共熔溶剂在非水体系中不能离子化。

1.5 天然氨基酸-天然植物酸

以L-脯氨酸-草酸、L-脯氨酸-葡萄糖、甜菜碱-苹果酸、盐酸甜菜碱-柠檬酸等为代表的天然低共熔溶剂，其分子间氢键作用更为明显，并与水发生剧烈反应。该类低共熔溶剂在天然产物的开发研究中具有广阔前景。

1.6 三元组分体系

随着学者对低共熔溶剂研究的不断深入，逐渐衍生出如以多元醇-酰胺-铵盐体系(如1,2-丙二醇-氯化胆碱-尿素)或甜菜碱-脯氨酸-蔗糖(或葡萄糖)等三元组分体系，进一步拓宽了低共熔溶剂的应用领域。

2 低共熔溶剂提取黄酮类化合物的影响因素

低共熔溶剂提取黄酮类化合物的影响因素主要包括低共熔溶剂的种类、组分物质的量比、料液比、含水量、提取温度、提取方法和提取时间等。

2.1 低共熔溶剂的种类

作为影响低共熔溶剂提取黄酮类化合物的最直接因素，不同的氢键供体和氢键受体会直接影响低共熔溶剂的极性，也会影响低共熔溶剂的黏度。李吉超[6]研究了以氯化胆碱为氢键受体，多元醇(乙二醇、1,2-丙二醇、丙三醇、1,2-丁二醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇、二乙二醇、三乙二醇)为氢键供体的低共熔溶剂体系对银杏叶黄酮的提取，获得氯化胆碱-乙二醇、氯化胆碱-1,4-丁二醇、氯化胆碱-三乙二醇3种体系的关联模型。姚金昊等[7]研究了天然低共熔溶剂体系对银杏叶中黄酮的提取，采用COSMO-RS方法筛选以氯化胆碱为氢键受体，尿素、甘油、乳酸、柠檬酸、丙二酸、草酸为氢键供体的低共熔溶剂体系，筛选出氯化胆碱-甘油为最佳低共熔溶剂体系。刘丹宁[8]考察了14种氢键供体与氯化胆碱、2种乙酸钠/乙酸铵和乳酸体系对枳实黄酮类化合物的提取，筛选出氯化胆碱-醋酸为最佳低共熔溶剂体系。都宏霞等[9]研究了茉莉花黄酮的提取，筛选出甜菜碱盐酸盐-蔗糖为最佳低共熔溶剂体系；研究了桂花黄酮的提取，筛选出氯化胆碱-山梨醇-1,2-丙二醇为最佳三元低共熔溶剂体系。可见，提取黄酮类化合物时，氢键受体多用氯化胆碱，其它低共熔溶剂体系报道较少。

2.2 低共熔溶剂组分的物质的量比

文献报道，低共熔溶剂组分的物质的量比对有效成分提取率的影响并不十分显著，部分研究中并不将其作为影响因素考察[9-11]，也有学者对低共熔溶剂组分的物质的量比进行了较为系统的研究。李吉超[6]分别制备了组分物质的量比为1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6的低共熔溶剂体系，研究了银杏叶黄酮的提取。Wei等[12]采用BBD实验设计法，对黄芩中的4种黄酮类化合物进行提取，发现以氯化胆碱和乳酸组成的低共熔溶剂体系，在其物质的量比为1∶2时，4种黄酮类化合物的提取率最高。Qi等[13]采用氯化胆碱-甜菜碱盐酸盐-乙二醇低共熔溶剂体系，在其物质的量比为1∶1∶2时，犬问荆中4种黄酮类化合物的提取率均达到最高。夏伯侯等[14]研究了6种不同低共熔溶剂体系提取夏枯草总黄酮，发现随氯化胆碱-乙二醇的物质的量比的增大，总黄酮提取率呈上升趋势，随氯化胆碱-丙三醇、氯化胆碱-2,3-丁二醇的物质的量比的增大，总黄酮提取率呈先升高后下降的趋势；氯化胆碱-1,2-丙二醇、氯化胆碱-1,4-丁二醇则在物质的量比较小时，表现出较高的总黄酮提取率。

2.3 料液比

料液比是低共熔溶剂对活性成分提取率影响最主要的因素，料液比的减小(即提取溶剂用量的增加)会提高体系的溶解性，但料液比超过一定值后，对活性成分的提取趋于饱和。熊苏慧等[15]以醋酸钠-乳酸提取玉竹总黄酮，研究料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，g∶mL，下同)对总黄酮提取率的影响。都宏霞等[9]研究低共熔溶剂提取茉莉花黄酮类化合物，在料液比分别为1∶40、1∶60、1∶80、1∶100、1∶120、1∶140、1∶160时，茉莉花黄酮提取率在6～13 mg·g-1范围内。随着料液比的减小，物质与溶剂的接触面积增大，有益于有效成分的浸出，但料液比过小时，溶液稀释，提取率反而下降，这也证实随着提取溶剂用量的增加，有效成分提取率升高，但溶剂用量过多亦会使提取量达到饱和状态。且若采用超声辅助低共熔溶剂法进行提取，料液比过小，还会引起因溶剂过多，超声波能量传导受阻，从而抑制有效成分的提取[9-10]。

2.4 含水量

低共熔溶剂一般黏度较大，主要原因可能是氢键供体和氢键受体间产生氢键吸附作用，从而导致低共熔溶剂组分的流动性降低，一般来说，低共熔溶剂比传统的提取溶剂黏度大1～2个数量级，这也限制了低共熔溶剂的使用，因此在进行活性成分提取时，研究人员常引入一定量的水，以降低低共熔溶剂的黏度[3]。熊苏慧等[15]在研究低共熔溶剂提取玉竹总黄酮时发现，当低共熔溶剂含水量为22%时，提取率最高；当含水量进一步升高时，提取率反而下降，这也与氢键吸附原理的预测相一致。也有学者指出，虽然含有一定的水能够加速植物药材的膨胀，但是过高的含水量会使得溶剂极性增大，反而不利于黄酮类化合物的浸出[16]。

2.5 提取温度

一般来说，提取温度越高，有效成分的提取率越高，但过高的提取温度可能会导致细胞破坏，同时升高提取温度会降低低共熔溶剂的黏度。研究[11,17]发现，控制提取温度在50～80 ℃范围内，能够较好完成对黄酮类化合物的提取。结合超声方法对植物中黄酮类化合物进行提取，当提取温度达到70 ℃时，提取率最高；提取温度高于70 ℃时，则可能由于黄酮类化合物基本结构被破坏，提取率下降。这一提取温度恰与大多数低共熔溶剂熔点在70 ℃以内这一现象相吻合。因此，在低共熔溶剂提取过程中，控制提取温度在50～80 ℃范围内，一方面保护了黄酮类化合物结构，另一方面也满足了低共熔溶剂呈液态提取这一参数条件。

2.6 提取方法

低共熔溶剂提取黄酮类化合物的方法除一般提取法外，还包括超声提取法、微波辅助提取法、负压空化提取法和冷冻辅助法等。熊苏慧等[15]采用超声辅助提取法，以醋酸钠-乳酸为提取溶剂，玉竹总黄酮的提取率达20.13 mg·g-1，比传统溶剂提取高1.51～2.26倍。Wei等[12]采用微波辅助法对黄芩中4种黄酮类化合物进行提取，提取时间为12 min，提取率相比于传统工艺大幅提升。Wang等[17]通过微波辅助法和超高压辅助法提取黄芩中黄芩苷，其提取率分别为10.696%和11.680%。此外，还有团队研究酶法提取技术，以氯化胆碱-尿素为提取溶剂，进行生物提取，黄芩苷转化率达90%以上[18]。崔琦[19]比较了微波辅助法和超声辅助法对沙棘叶中5种黄酮类化合物的提取效果，结果发现，微波辅助法提取率明显优于其它方法。Qi等[13]结合负压空化法对比传统的甲醇提取法和超声辅助提取法对犬问荆中4种黄酮类化合物的提取效果，结果表明，负压空化提取法在低共熔溶剂的应用方面也具有良好的发展前景。Nam等[20]提出采用冷冻辅助法对槐花中黄酮类化合物进行提取，结果表明，提取率比传统提取法的高14%。

2.7 提取时间

提取时间延长，可以促进物质有效成分的溶出，但提取时间过长又会导致物质成分结构因热效应而遭到破坏。采用超声辅助、微波辅助等技术可以显著缩短提取时间。孙平等[11]采用超声辅助法提取野菊花中黄酮类化合物，发现当提取时间为40 min时，提取率最高，但提取时间延长到60 min时，提取率反而下降，这可能是由于超声波的强机械效能导致物质发生分解。在微波辅助提取过程中，提取时间一般为10～15 min[17,19]。负压空化提取法提取时间则为4 min左右[20]，明显提高了提取效率。

3 低共熔溶剂提取黄酮类化合物的其它研究

3.1 生物活性

文献报道，黄酮类化合物具有显著的抗氧化活性，但经低共熔溶剂提取的黄酮类化合物比传统方法具有更高的抗氧化活性，值得学者关注和研究。Nam等[20]通过冷冻辅助法，以L-脯氨酸-甘油(2∶5，体积比)为提取溶剂对槐花中黄酮类化合物进行提取，并对其抗氧化活性进行研究，结果显示，低共熔溶剂提取物比传统溶剂提取物具有更显著的抗氧化活性。孙悦等[21]采用氯化胆碱-柠檬酸为溶剂提取鹰嘴豆黄酮，并研究其对DPPH自由基、·OH、ABTS自由基的清除作用，以抗坏血酸(VC)为对照，结果显示，当黄酮浓度达到0.5 mg·mL-1和1.5 mg·mL-1时，黄酮类化合物均具有明显的抗氧化活性。崔琦[19]通过微波辅助法，以氯化胆碱-1,4-丁二醇为提取溶剂，结合大孔树脂纯化沙棘叶中黄酮类化合物，通过计算IC50值研究其抗氧化活性。除抗氧化作用外，刘丹宁[8]采用超声辅助法优化枳实黄酮的低共熔溶剂提取工艺，并对腹泻小鼠模型进行给药，结果发现，低共熔溶剂提取枳实黄酮对于腹泻小鼠症状有明显改善，并且对丰富肠道菌群有明显促进作用。

3.2 低共熔溶剂的回收

目前，低共熔溶剂在使用过程中存在低挥发性的难题，使得提取物难以与低共熔溶剂分离，因此，一般情况下常通过大孔树脂对溶剂进行回收，从而达到与提取物分离的目的。基于绿色环保理念，回收后的低共熔溶剂仍可再利用。Gu等[22]运用HPLC对回收的低共熔溶剂进行分析，结果发现，回收的低共熔溶剂与新制备低共熔溶剂基本一致。崔琦[19]采用PD-826、DM-130、D-3520、NKA-9、AB-8和D101等6种大孔树脂对提取得到的沙棘黄酮进行分离和富集，结果发现，AB-8型大孔树脂对黄酮类化合物的回收率最高，这也为其它黄酮类化合物的分离提供借鉴，分离后的低共熔溶剂仍可再利用。

4 展望

低共熔溶剂虽在中药有效成分的提取方面应用较晚，但因其成本低廉、制备简单、配比选择广泛、提取率高、绿色无毒、可回收再利用，有着不可替代的优势。但是低共熔溶剂在应用过程中仍存在一定的局限性：溶剂黏度过大导致提取物与溶剂不易分离，也有研究报道可采用加入一定比例(5%～20%)的水以降低溶剂黏度，或可采用大孔树脂分离技术对溶剂进行回收[19]；溶剂配比现主要局限于以氯化胆碱为氢键受体，其它报道则较少，且在研究中多研究二元体系，对三元体系的研究较少。在今后的研究中，应加强低共熔溶剂种类研究，扩大选择范围；虽然低共熔溶剂是一种绿色溶剂，绝大多数无毒，但少数也具有毒性，低共熔溶剂的毒性和致毒原因也应加强研究；在低共熔溶剂提取黄酮类化合物过程中，加强提取新技术的研发，提高有效成分的提取率。低共熔溶剂提取物的生物活性研究较传统溶剂的少，也是值得研究的方向。随着国内外对绿色化学越来越重视，绿色低共熔溶剂对中药活性成分高效提取的应用值得持续深入研究，对绿色溶剂的标准化建立也是今后绿色化学发展的趋势和分支。