油污降解菌剂YW-I的制备及降解油污实验

司晓光，张晓青，成 玉，曹军瑞

(自然资源部天津海水淡化与综合利用研究所，天津 300192)

石油在开采、冶炼、运输和使用过程中，经常会伴随着石油泄漏导致的环境污染[1-3]。同其它污染物相比，油污与土壤之间具有更强的亲和力，因此，油污土壤的治理难度更大，成本更高[4-6]。

目前，油污土壤的治理方法主要有物理法、化学法和生物法，其中物理法、化学法的治理成本较高，操作复杂，技术要求较高，同时治理不合理会产生二次污染。而生物法中的微生物修复则具有成本低、效率高、无二次污染等优点，成为世界各国学者研究的热点之一[7-10]。微生物修复是指利用微生物的代谢机理，通过人为添加土著微生物或者外源微生物，并为其提供适宜的生存环境，从而提高其代谢速率，以达到去除油污的目的[11-14]。

作者将实验室筛选的油脂降解菌YZ-042发酵液与生物表面活性剂产生菌BM-029发酵液进行复配，制备油污降解菌剂YW-I(简称YW-I菌剂)，拟为油污土壤的治理提供可靠的技术产品。

1 实验

1.1 材料

原油样品：采自天津大港油田，常温下为黑色黏稠物，密度为0.862 g·mL-1，室温下黏度为12.35 mm2·s-1。

污染土壤：采自天津大港油田原油污染区域，土壤样品呈棕色至褐色。

菌株YZ-042：本实验室保存的一株用于降解油脂的菌株，筛选自油田附近的土壤样品。

菌株BM-029：本实验室保存的一株产生物表面活性剂的菌株，筛选自海河入海口附近的淤泥。

种子培养基：牛肉膏 3 g、蛋白胨 5 g、NaCl 5 g、蔗糖 9 g，定容至1 L，灭菌。

发酵培养基：氯化铵0.5 g、硫酸镁0.15 g、三氯化铁0.1 g、磷酸氢二钾0.3 g、磷酸二氢钠0.5 g、氯化钙0.1 g、玉米淀粉糖化液2 g、玉米浆5 g，定容至1 L，灭菌。

油污降解培养基：氯化铵0.5 g、硫酸镁0.15 g、三氯化铁0.1 g、磷酸氢二钾0.3 g、磷酸二氢钠0.5 g、氯化钙0.1 g、玉米淀粉糖化液0.5 g、玉米浆3 g、原油5 g，定容至1 L，灭菌。

1.2 YW-I菌剂的制备

将菌株YZ-042、BM-029分别用平板划线法接种于种子培养基中，30 ℃培养箱中培养48 h，挑取单菌落接种于发酵培养基中，30 ℃摇床培养48 h，获得菌株YZ-042、BM-029的发酵液。将两种发酵液分别按复配比例(VYZ-042发酵液∶VBM-029发酵液)1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1制备液体YW-I菌剂，经离心、洗涤、干燥后，获得YW-I菌剂。

1.3 YW-I菌剂的保存条件研究

将YW-I菌剂分别保存在低温(4 ℃冰箱)、室温(约25 ℃)和高温(40 ℃)下，分别于0 d、30 d、60 d和90 d取样，采用稀释涂布法测定YW-I菌剂中的有效活菌数，考察保存温度和保存时间对YW-I菌剂的影响。

1.4 YW-I菌剂降解油污实验

取2 g YW-I菌剂接种到油污降解培养基中，30 ℃摇床培养，每隔24 h取样，测定油污去除率。以灭活的YW-I菌剂作为对照。

1.5 油污土壤修复实验

称取干化的污染土壤10 g，加入到未受石油污染的土壤中，获得油污土壤；另取10 g YW-I菌剂溶于10 mL发酵培养基中，稀释至100 mL，获得YW-I土壤修复液。按照油污土壤质量的2%喷洒YW-I土壤修复液，每隔2 d喷洒清水保持土壤湿润，分别于0 d、10 d、20 d、30 d取样，测定土壤中油污含量。以灭活的YW-I菌剂作为对照。

1.6 分析方法

1.6.1 有效活菌数的测定

称取1 g YW-I菌剂加入到250 mL无菌锥形瓶中，加入10颗玻璃珠、50 mL无菌水，充分摇匀，稀释至不同梯度；取100 μL稀释液涂布到平板上，30 ℃下培养48 h，计算有效活菌数。

1.6.2 发酵液中油污去除率的测定

将100 mL YW-I菌剂降解油污实验发酵液转移到分液漏斗中，加入50 mL石油醚，充分混匀、振荡，静置分层，取上层有机相，加入无水硫酸钠脱水；吸取0.5 mL脱水后的有机相至50 mL容量瓶中，用石油醚定容；测定235 nm处的吸光度(A)。测定对照组235 nm处的吸光度(A0)。油污去除率按式(1)计算：

(1)

1.6.3 土壤中油污含量的测定

取2 g油污土壤样品，置于干燥器中干燥后粉碎，用质量为M1的干净滤纸包好，以石油醚为萃取剂，索氏抽提萃取5 h；取出滤纸包在烘箱中恒温烘干，然后置于干燥器中冷却至室温，称重为M2；用重量法测定索氏抽提萃取液中的油污质量M3，土壤中油污含量按式(2)计算：

(2)

2 结果与讨论

2.1 YW-I菌剂的复配比例优化(图1)

图1 复配比例对油污去除率的影响

由图1可以看出，菌株YZ-042发酵液和菌株BM-029发酵液的复配比例对油污去除率有一定的影响，在复配比例为2∶1时，油污去除率最高。油污的微生物降解是一个复杂的微生物反应过程，是菌群协同作用的结果，需有专门的以油脂作为自身生长繁殖要素的微生物，同时还应有增加油污与水相互溶的微生物或其相关活性产物。YW-I菌剂中既有油脂降解菌，又有生物表面活性剂产生菌，大大提高了油污的降解效率。选择YW-I菌剂的最佳复配比例为2∶1。

2.2 YW-I菌剂的保存条件研究(图2)

图2 保存条件对YW-I菌剂的影响

由图2a可以看出，随着保存时间的延长，40 ℃下保存的YW-I菌剂的有效活菌数不断减少，90 d后YW-I菌剂的有效活菌数的数量级由最初的1011降至105；而4 ℃和25 ℃下保存90 d后，YW-I菌剂的有效活菌数的数量级分别为1010和109。可见，YW-I菌剂中的活菌对温度较为敏感，低温和室温条件下保存90 d后有效活菌数的数量级仍在109以上，满足使用要求。温度影响微生物的生长代谢，通常温度越低，微生物的生长代谢越缓慢，越有利于微生物的保存；但是低温保存会增加保存成本。综合考虑，YW-I菌剂常温保存。

由图2b可以看出，随着保存温度的升高和保存时间的延长，油污去除率总体呈下降趋势，与图2a中有效活菌数的变化趋势一致。表明，YW-I菌剂降解油污效果与YW-I菌剂的有效活菌数有关。

2.3 YW-I菌剂降解油污效果(图3)

由图3可以看出，0～3 d内，随着降解时间的延长，实验组和对照组的油污去除率均逐渐升高，而3 d后对照组的油污去除率基本维持不变，约为11.54%；而实验组的油污去除率则继续升高，7 d时达到最高，为33.24%。表明添加YW-I菌剂后，能显著去除发酵液中的油污。通常单一菌种对油污的降解能力有限，而将不同菌种复配构成复合菌剂，则能让微生物发挥协同作用，共同完成油污的降解过程。

图3 YW-I菌剂对油污的降解效果

2.4 油污土壤修复效果(图4)

图4 YW-I菌剂修复油污土壤的效果

由图4可以看出，土壤中最初的油污含量为2.5%，经过30 d的降解后，实验组土壤中的油污含量降为1.23%，油污去除率达到50.8%，而对照组的油污含量为2.4%,油污去除率仅为4%。实验发现，YW-I菌剂修复油污土壤与摇瓶中的油污降解实验不同，在油污土壤中，YW-I菌剂的作用时间更长(需要30 d的降解周期)，降解效率更高(油污去除率50.8%)；而在摇瓶中降解7 d即达到最高油污去除率33.24%(图3)。YW-I菌剂应用于油污土壤的修复，是多相、非均质的复杂过程，涉及微生态、环境化学、土壤学等学科，还需要更深入的研究YW-I菌剂修复油污土壤的工艺条件，以提高对油污的降解效率。

3 结论

将油脂降解菌YZ-042发酵液与生物表面活性剂产生菌BM-029发酵液按最佳复配比例2∶1制备油污降解菌剂YW-I。在4 ℃下保存30 d后的YW-I菌剂的有效活菌数的数量级仍保持在初始数量级1011，在25 ℃下保存30 d后的YW-I菌剂的有效活菌数的数量级为1010，在4 ℃和25 ℃下保存90 d后的YW-I菌剂的有效活菌数的数量级分别为1010和109，综合分析保存经济成本，YW-I菌剂可以常温保存。YW-I菌剂在油污发酵液中的降解周期约为7 d，油污去除率最高为33.24%。YW-I菌剂用于油污土壤修复30 d后，土壤中的油污去除率达到50.8%，油污降解效果明显。