暗诱导绞股蓝根状茎形成过程中的内源激素和糖含量变化

彭 震， 朱 里， 罗 庆， 高建有， 查满荣， 彭小列， 郭惠红， 刘世彪

(1.吉首大学生物资源与环境科学学院， 湖南 吉首 416000；2.北京林业大学生物科学与技术学院， 北京 100083)

绞股蓝(Gynostemmapentaphyllum)别名七叶胆、五叶参、公罗锅底等，是葫芦科绞股蓝属多年生草质藤本植物。主要分布于秦岭以南地区，因其所含的绞股蓝皂苷(gypenosides)与人参皂苷(ginsenoside)具有相同的达玛烷构型而被誉为“南方人参”。此外绞股蓝还含有黄酮类、多糖、氨基酸等多种生理活性物质，其药理功效包括保护肝脏和心血管、抗炎症和病毒、调节免疫和神经系统功能、抗肿瘤抗氧化、降血糖血脂等，可用于多种病症的治疗，是一种重要的药食两用植物和保健植物[1-2]。

绞股蓝有种子繁殖和营养繁殖两种形式。自然条件下其营养繁殖通常以地下根状茎分蘖、匍匐茎节位形成不定根和不定芽形式产生新的植株。但在秋末冬初时，绞股蓝存在一种特殊的营养繁殖现象：其藤蔓会下垂生长，芽端触地后节间伸长膨大，末端弯曲并钻入土中越冬，并在地下形成根状茎，这种芽一般称之为“珠芽”[3]。珠芽在地下分化出多个侧芽和侧枝，来年开春后可萌发出数株新苗，而原来的母株藤蔓则在冬季枯死[4]。对于绞股蓝的这种生长行为，人们通常视之为适应寒冷环境的越冬和繁殖策略。杨琦[5]研究发现，在各阶段中的绞股蓝地上茎向根状茎发育转变过程中，其组织结构相似，只是后期的细胞体积明显增大，地下根状茎的皮层淀粉鞘和髓细胞中的淀粉粒数量和体积明显增大。目前对绞股蓝茎端向根状茎转化的生理变化尚不了解，但笔者观察发现，绞股蓝茎端在秋末会沿地面朝暗处生长，茎端黄化并膨大，继而再钻入土中，因此推测秋冬的短日照可能是其行为变化的重要诱因。为此，本实验检测了暗诱导条件下绞股蓝茎端转化为根状茎过程中的内源激素和糖分含量变化，以进一步探索其茎端形态和行为转化的生理机制。

1 材料与方法

1.1 植物材料

供试材料为生长正常的平利2号绞股蓝，盆栽于吉首大学种质圃。实验于2020年6月中下旬进行。

1.2 仪器与试剂

FA 1204电子天平，TG-16 G台式高速离心机，T 6 新世纪紫外可见分光光度计，AGLIENT 1290高效液相色谱仪，SCIEX-6500 Qtrap(MSMS)，CHA-2气浴恒温摇床，水浴氮吹仪；茉莉酸(JA)标准品和吲哚乙酸(IAA)标准品、赤霉素(GA3、GA4、GA7)标准品，CNWC 18 QuEChers填料，色谱级甲醇和乙腈。

1.3 实验方法

1.3.1绞股蓝茎端的暗处理及取样

取大小为16 cm×4.5 cm的透明聚酯PET塑料瓶，用2层黑色塑料膜紧缠于外面，瓶盖开小孔以套进绞股蓝茎端，以不缠膜的塑料瓶为对照。选取同一株长势与形态相似的绞股蓝的5枝藤蔓，其中3枝的茎端分别置于暗处理瓶中，1枝茎端置于对照瓶中，茎端插入瓶中约10 cm,剩余1枝直接剪下芽尖至第4节材料作为初始期。抽样观察表明，暗处理3 d的茎端进入黄化膨大期，暗处理6 d的茎端进入变态芽期(出现顶端弯曲，自然条件下由弯曲处接触土面并钻入)，暗处理8 d后的茎端进入根状茎期(第3～5节长出不定根)，而在对应时间的对照组瓶内茎端均无上述变化(图1)。 在各时期取样，剪取各时期材料的芽尖至第4节材料，迅速浸入液氮中，转至-80 ℃冰箱中保存，用于激素含量测定。剪取相应材料贮存于-80 ℃冰箱保存，用于糖含量测定。3次生物学重复。

注：A为暗处理；B为对照茎端；C为黄化膨大期茎端；D为变态芽期茎端；E为根状茎期茎端。图1 绞股蓝茎端暗处理及其4个典型形态时期Fig.1 Dark treatment for stem apex and three development stages of G.pentaphyllum

1.3.2绞股蓝茎端激素含量测定

采用液质联用法检测IAA、赤霉素类(GA3、GA4、GA7)和JA浓度。

1) 配置标曲溶液：取1.5 mL离心管，加入甲醇溶液994 μL与2 μL浓度为500 μg/mL激素标准品储备液，摇晃震荡均匀，配置成终浓度1 μg/mL的母液。取甲醇溶液和母液配置为终浓度0.1 ng/mL，0.2 ng/mL，0.5 ng/mL，2 ng/mL，5 ng/mL，20 ng/mL，50 ng/mL，200 ng/mL的标曲溶液。

2) 流动相配置：色谱纯甲醇900 mL作为有机相加入1 L容量瓶，再加入1 mL甲酸，以色谱纯甲醇定容至1 L并混匀。取超纯水900 mL加入1 L容量瓶作为无机相，再加入1 mL甲酸，以超纯水定容至1 L并混匀。

3) 植物激素提取步骤：在10倍体积乙腈溶液中加入精确称取的样品0.1 g，4 ℃环境下提取过夜，12 000 r/min离心5 min，取其上清液；沉淀后再加一次5倍体积乙腈溶液，合并提取2次后所得上清液；加入10 mg C 18填料，剧烈震荡30 s，10 000 r/min离心5 min，取上清液；氮气吹干后再以200 μL甲醇复溶，过0.22 μm孔有机相滤膜，放入-20 ℃冰箱低温保存，待上机检测。

4) HPLC-MS/MS检测：液相条件为色谱柱：poroshell 120 SB-C 18反相色谱柱(2.1×150，2.7 μm)；柱温30 ℃，流动相：A∶B=(甲醇/0.1%甲酸)∶(水/0.1%甲酸)；进样量：2 μL，进行梯度洗脱，梯度条件如表1。质谱参数：以ESI正负离子模式分别监测为电离方式。扫描类型：MRM，气帘气：15 psi，喷雾电压：+4 500 V，-4 000 V，雾化气压力：65 psi，辅助气压力：70 psi，雾化温度：400 ℃。

表1 液相梯度参数Table 1 Gradient parameters of HPLC

1.3.3绞股蓝茎端糖含量测定

采用紫外可见分光光度计测定绞股蓝茎端样品中的糖含量(鲜重)。采用间苯二酚法于480 nm处测吸光值换算成蔗糖和果糖含量，蒽酮比色法于625 nm处测吸光值换算成可溶性糖和淀粉含量，DNS(二硝基水杨酸)法于520 nm处测吸光值换算成还原糖含量。

2 结果与分析

2.1 绞股蓝茎端植物激素含量的动态变化

图2显示，在暗处理前后的绞股蓝四个典型形态时期中，IAA含量呈波动态势，与初始期(1.45 ng/g)相比，黄化膨大期的IAA含量上升至最高水平(3.13 ng/g),在变态芽期IAA含量有所下降(1.50 ng/g)，在根状茎期含量又有所上升(2.30 ng/g)。GA类激素含量从初始期的1.12 ng/g急剧上升至黄化膨大期的最高值(5.74 ng/g)，后又急剧下降到变态芽期的0.58 ng/g，再平缓下降至根状茎期的0.32 ng/g。绞股蓝茎尖的JA含量水平最高，在11～41 ng/g之间，暗处理后其含量由初始期的33.30 ng/g上升到黄化膨大期的40.53 ng/g，之后再下降至变态茎期的30.62 ng/g和根状茎期的11.47 ng/g。总体来看，黄化膨大期的激素含量均达最高值，应是绞股蓝茎端由正常茎向根状茎转化的必要阶段和关键时期。其后的变态芽期均呈下降趋势，至茎尖长出不定根成为根状茎后，GA和JA仍保持低浓度状态，而IAA有所上升。

图2 绞股蓝茎端暗处理各期的植物激素含量Fig.2 Phytohormone content in stem apex of G.pentaphyllum at three development stages in dark treatment

2.2 绞股蓝茎端糖含量的动态变化

绞股蓝茎端转变不同时期的糖含量变化如图3所示。与初始期相比，绞股蓝茎端暗处理后可溶性糖和淀粉含量呈连续下降趋势，在根状茎期降至最低。蔗糖和果糖则呈平缓上升趋势，但幅度极小。还原性糖在黄化膨大期含量较低，但在其后的变态芽期和根状茎期呈明显上升趋势。

图3 绞股蓝茎端暗处理各期的糖含量Fig.3 Sugar content in stem apex of G.pentaphyllum at three development stages in dark treatment

3 讨 论

根状茎作为植物越冬时的储存器官，具有碳水化合物、营养物质和水的储藏功能，其发育是一个复杂的生物学进程，由不同的内源物质和环境因子等诱导发生。李良俊等[6]发现，生长素在莲藕根状茎形成过程中的不同阶段具有不同的作用，生长素在桃枝不定根的发生中也起着重要促进作用[7]。本研究中，绞股蓝根状茎阶段发育出不定根时，其他激素含量都呈下降趋势，唯有生长素有所上升，应是与其促进不定根生成的功能有关。双子叶植物种子发育成幼苗时，其下胚轴顶端部位的外侧细胞生长素积累较少而生长快，内侧细胞生长素积累较多而生长慢，从而形成“顶端弯钩”结构[8]，以使得子叶和顶端分生组织在出土过程中免受土壤带来的机械损伤，保证幼苗正常出土。绞股蓝变态茎尖钻入土中后也会形成弯钩结构，只不过幼苗是出土而绞股蓝是入土，其原理是相同的。赤霉素也能够促进拟南芥顶端弯钩的形成[9]，促进豌豆黄化苗茎段的伸长生长[10]。在马铃薯匍匐茎伸长过程中、尤其是匍匐茎顶端开始膨胀时内源性赤霉素含量较高[11]，本研究中，绞股蓝赤霉素类在黄化膨大期含量增至最高、且能促进变态芽时期的弯钩形成，说明赤霉素可能是促成绞股蓝茎端转化的主要调节激素。作为重要的植物激素和信号分子，茉莉酸可以诱导洋葱储藏器官的形成和增加储藏器官的数量[12]，茉莉酸在调节拟南芥暗形态建成过程中与光信号通路具有互作关系，它能在暗中抑制乙烯诱导的拟南芥幼苗顶端弯钩的形成，抑制下胚轴伸长并促进子叶打开[9,14]。本研究中的绞股蓝茉莉酸含量在变态芽和根状茎时期的含量持续下降，表现出与幼苗出土的相反功能，以适应暗环境。在暗诱导的绞股蓝茎端转化中，IAA、GA和JA含量均在黄化膨大期明显上升而后又明显下降，表明这一时期可能是根状茎形成的必要阶段和关键时期。

糖不仅为植物生长提供物质和能量，它也是一种诱导信号分子，并与其他信号如植物激素组成复杂的信号网络体系，其具体的表现形式多为蔗糖或山梨醇，而后在储藏器官形成中发挥作用[13]。蔗糖是储藏器官形成的强诱导剂，土豆培养基中蔗糖浓度的增加会导致块茎数量增加[15]，40 g/L的蔗糖最利于人参不定根的生长[16]。本研究绞股蓝茎端的蔗糖含量平缓上升，有助于促进不定根的形成。淀粉是储藏器官的重要成分，是在一系列酶的协同作用下以蔗糖为起始点催化合成的，是莲藕根状茎膨大过程中的重要代谢过程[17]。南荻根状茎中的淀粉在11月中旬成熟期达最大值，在5月营养生长旺盛期具最小值，而可溶性糖含量正好相反，在11月中旬最低，5月最高[18]。绞股蓝茎端在暗诱导形成根状茎过程中，淀粉含量并没有增高而是降低，因为夏季正是绞股蓝的生长季，并不利用淀粉积累，可溶性糖也是如此。果糖主要用于根状茎膨大过程中细胞的构建，以促进新器官的形成[19]，在绞股蓝根状茎的发育过程中其细胞数量和体积均有所增加[5]，所以果糖的供应相应增加。由于本实验期较短，糖类含量变化的规律尚不明显。

绞股蓝根状茎的发育转变与光照尤其是光周期密切相关。通常短日照能促进储藏器官的形成，叶片可感知光照强度在叶片维管束内合成信号并进行传递，经韧皮部转运到营养茎尖或匍匐茎尖，从而导致根状茎等储藏器官发生[17]。短日照通过调节光周期信号转导相关蛋白而促进储藏器官的形成，它可使马铃薯伸长的匍匐茎停止生长，顶端及其下端细胞通过横向、随即分裂使匍匐茎膨大称为块茎[20]。极度短日照即趋近于暗诱导，暗诱导涉及包括乙烯和脱落酸在内的多种激素、COP/DET/FUS信号复合体和PIFs转录因子等的整合调控，影响植物生长发育[21]。绞股蓝根状茎的形成也应是由短日照引起的，本研究的暗诱导能快速引发其正常茎端向根状茎发育，并伴随内源激素和糖的变化，但其深层的机理有待研究。同时，绞股蓝地上茎转化为根状茎并钻入土中的现象又是一种向重力性转变。本课题组研究发现，几个编码YUCCA、IDD、LAZY 1和ARP 2/3复合体的向地性基因在绞股蓝茎端转变过程中具有明显的上调表达，使地上茎获得类似于根的正向地性生长[22]。此外，参与植物激素信号转导、碳水化合物代谢、光周期、苯丙烷生物合成和其他与植物根状茎发育相关的差异表达基因对应的miRNA也参与了这一转变。上述基因和miRNA的表达多数涉及其对植物激素的调控，而植物激素信号合成途径又与光暗信号刺激密切相关[23]。因此，这提示可从光暗诱导—相关基因调控—植物激素合成—根状茎转化的线索对绞股蓝的茎端行为进行进一步研究。